精子梯度分離液的細菌內(nèi)毒素測定

陳鴻波 孫聰慧 陳丹丹

0 引言

細菌內(nèi)毒素檢查是安全性檢測的關(guān)鍵指標之一，在藥品、生物制品和醫(yī)療器械檢驗中是一項重要的質(zhì)控技術(shù)，目前已被許多國家的藥典標準收錄[1]。細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁的脂多糖成分，是最普遍和最主要的外源性致熱原[2]，極微量(1～5 ng/kg)進入人體即可引起發(fā)熱反應(yīng)[3]，大劑量可能會導(dǎo)致內(nèi)毒素中毒休克、彌散性血管內(nèi)凝血，甚至死亡[4]。細菌內(nèi)毒素含量過高不僅會導(dǎo)致人體發(fā)燒，還會產(chǎn)生細胞毒性。目前最常規(guī)的細菌內(nèi)毒素檢測方法是凝膠法，此外還有動態(tài)顯色法和動態(tài)濁度法兩種定量方法也收錄在藥典中。其中，動態(tài)顯色法是根據(jù)游離的對硝基苯胺與細菌內(nèi)毒素濃度成正比的相對關(guān)系而進行定量測定的一種分析方法[5]。 動態(tài)濁度法是根據(jù)反應(yīng)液渾濁度上升的速度和反應(yīng)液中內(nèi)毒素濃度成比例的原理所設(shè)計的定量測定方法[6]。

精子梯度分離液作為輔助生殖類醫(yī)療器械，其安全性檢測是臨床使用安全的必要保證。該樣品為含有硅烷涂層二氧化硅顆粒的懸浮性緩沖溶液，其主要成分中的硅烷涂層SiO2(含有二氧化硅納米粒子，19 nm±4 nm，用于梯度分離)、穩(wěn)定pH的羥乙基哌嗪乙硫磺酸、螯合劑二水合乙二胺四乙酸二鈉、NaCl、KCl和CaCl2，其作用是調(diào)節(jié)滲透壓。其他的成分葡萄糖、乳酸鈣和丙酮酸鈉用于提供能量，還有純化水等。由于該樣品成分復(fù)雜，常規(guī)的凝膠法有干擾無法進行檢測，所以必須為這類復(fù)雜成分樣品的細菌內(nèi)毒素實驗建立方法，滿足臨床使用的安全性。以往的相關(guān)研究中這些內(nèi)毒素檢測方法在使用時，通常一個樣品只會用一種細菌內(nèi)毒素方法進行檢測。本研究在國內(nèi)外首次提出動態(tài)濁度法和動態(tài)顯色法兩種定量實驗方法互相印證，保證了實驗結(jié)果的準確。

1 方法

1.1 測試樣品

精子梯度分離液，規(guī)格：100 mL/瓶，批號：00PS4019002，型號：PS40-100。

1.2 細菌內(nèi)毒素檢測實驗[7-12]

1.2.1 標準曲線可靠性驗證實驗

按照《中國藥典》細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進行鱟試劑的標準曲線可靠性實驗，動態(tài)顯色法和濁度法鱟試劑經(jīng)用細菌內(nèi)毒素國家標準品檢查，結(jié)果符合規(guī)定。

所得標準曲線相關(guān)系數(shù)r的絕對值均大于0.980，符合標準曲線可靠性驗證的要求。

1.2.2 精子梯度分離液最大有效稀釋倍數(shù)(maximum valid dilute double,MVD)的計算公式

MVD=L×C/λ

式中：L為精子梯度分離液的細菌內(nèi)毒素限值0.5 EU/mL。C為供試品的濃度，當L以EU/mL表示時，則C等于1.0 mL/mL。λ為所用標準曲線的最低檢測限0.01 EU/mL。

則精子梯度分離液的對應(yīng)最大有效稀釋倍數(shù)為：

MVD=0.5 EU/mL×1.0 mL/mL÷0.01 EU/mL=50倍。

要在供試品的稀釋倍數(shù)不大于50倍的情況下進行細菌內(nèi)毒素檢測。

選擇10倍為實驗稀釋倍數(shù)。

1.2.3 實驗操作

(1) 標準曲線。取細菌內(nèi)毒素國家標準品，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至10 EU/mL、1 EU/mL、0.1 EU/mL、0.01 EU/mL，共4個濃度，每個濃度做2個平行孔檢測。

(2) 供試品溶液。取精子梯度分離液，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋10倍。供試品稀釋液做2個平行孔檢測。

(3) 供試品回收溶液。取供試品稀釋液0.1 mL，加入10 uL濃度為1 EU/mL細菌內(nèi)毒素標準溶液，使最終標準內(nèi)毒素含量為0.1 EU/mL，再加入0.1 mL鱟試劑，做回收率檢測，供試品回收溶液做2個平行孔檢測。

(4) 陰性對照。以細菌內(nèi)毒素檢查用水為陰性對照，做2個平行孔。

2 結(jié)果

2.1 動態(tài)顯色法內(nèi)毒素檢測實驗

標準曲線lgT=6.01+(-0.248lgC)，r=-1，鱟試劑批號：1904260，樣品稀釋倍數(shù)10倍，回收率105.6%，供試品溶液內(nèi)毒素濃度為0.195 EU/mL。

2.2 動態(tài)濁度法內(nèi)毒素檢測實驗

標準曲線lgT=6.04+(-0.233lgC)，r=-0.999，鱟試劑批號：1903290，樣品稀釋倍數(shù)10倍，回收率164.8%，供試品溶液內(nèi)毒素濃度為0.269 EU/mL。

3 討論與結(jié)論

為臨床使用安全，精子梯度分離液必須進行細菌內(nèi)毒素檢測。但是精子梯度分離液由于組成成分復(fù)雜，含有納米粒子、穩(wěn)定pH值成分、螯合劑成分、調(diào)節(jié)滲透壓成分、葡萄糖等成分，這些復(fù)雜的成分都有可能對細菌內(nèi)毒素實驗產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。例如，其中的螯合劑成分，會把內(nèi)毒素和鱟試劑反應(yīng)所必需的游離二價鈣鎂離子螯合，導(dǎo)致凝集反應(yīng)不能進行，但因本產(chǎn)品含有大量的氯化鈉和氯化鉀，替代了鈣鎂離子，因而未表現(xiàn)出抑制干擾作用，出現(xiàn)了假陽性結(jié)果。

在凝膠限量法實驗中，將樣品稀釋到最大有效稀釋倍數(shù)32倍[13-15]，樣品表現(xiàn)出強烈干擾，導(dǎo)致凝膠法無法進行檢測。于是將精子梯度分離液使用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋10倍，然后采用動態(tài)顯色和動態(tài)濁度法檢測，供試品的回收率均在50%～200%，符合細菌內(nèi)毒素光度測定法的要求。說明精子梯度分離液可適用細菌內(nèi)毒素動態(tài)顯色法和動態(tài)濁度法檢查，得出樣品細菌內(nèi)毒素含量分別為0.195 EU/mL和0.269 EU/mL，這兩種定量方法得出的檢測數(shù)值都是無干擾的有效數(shù)值，所以可以確認該產(chǎn)品(批號：00PS4019002)的細菌內(nèi)毒素含量是小于0.5 EU/mL的，低于規(guī)定的限值，符合規(guī)定。

為了輔助生殖類醫(yī)療器械臨床使用時減少不良反應(yīng)發(fā)生率，當含有納米成分的樣品用凝膠法無法檢測時，建議要有兩種定量方法檢測都合格，才能判定產(chǎn)品符合規(guī)定。本研究建立了精子梯度分離液的細菌內(nèi)毒素實驗檢測的方法，解決了含復(fù)雜成分的醫(yī)療器械在用凝膠法無法檢測時如何進行細菌內(nèi)毒素實驗的難題。本方法可以作為一種通用方法，對于復(fù)雜樣品具有很好的適用性，通過兩種不同反應(yīng)原理(一個是通過顏色變化進行定量，一個是通過濁度變化進行定量)的細菌內(nèi)毒素定量方法相互印證，可以保證結(jié)果正確，避免了假陽性和假陰性的可能性。

在二十余年的檢測工作中，筆者一共遇到兩個生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的精子梯度分離液，其中一個生產(chǎn)廠家的精子梯度分離液在細菌內(nèi)毒素實驗中可以使用凝膠法檢測，另一個生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品就是本文中提到的精子梯度分離液，用凝膠法有干擾，無法檢測。筆者猜測這兩個廠家的產(chǎn)品具體成分有不同因而導(dǎo)致凝膠法實驗中表現(xiàn)為有干擾和無干擾的兩種情況。本研究提出用兩種內(nèi)毒素定量方法互相印證的研究思路對精子梯度分離液進行了檢測，希望對業(yè)內(nèi)同行是一個有益的啟發(fā)。