胰腺癌免疫治療耐藥性機(jī)制研究進(jìn)展

孫敏慧 張?bào)泺P

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，五年的生存率僅為9%［1］。胰腺癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因此目前的治療手段主要為化療、放療和新輔助治療。免疫治療是一種新型的抗癌療法，旨在激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，協(xié)同機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤。目前應(yīng)用于臨床的免疫療法主要有免疫檢查點(diǎn)抑制劑、癌癥疫苗、過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移等，它們?cè)谘合到y(tǒng)腫瘤、黑色素瘤、肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤［2］中顯示出了良好的療效。然而O'REILLY［3］、WAINBERG［4］等多人的研究并未發(fā)現(xiàn)免疫治療明顯改善胰腺癌患者的總體生存時(shí)間和臨床控制率，其免疫治療單藥或聯(lián)合作用均不足以克服腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的免疫抑制作用。因此探索免疫治療耐藥性機(jī)制、研究新的治療方法對(duì)胰腺癌治療至關(guān)重要。

1 腫瘤微環(huán)境

TME指由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及其分泌性細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)等通過相互作用共同構(gòu)成的有利于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的動(dòng)態(tài)環(huán)境［5］?；|(zhì)的致密化及大量免疫抑制細(xì)胞浸潤(rùn)是PDAC微環(huán)境的特征，也是造成PDAC對(duì)免疫治療耐藥性的重要機(jī)制之一。因此打破TME，才能更好地發(fā)揮免疫治療的作用。

1.1 基質(zhì)致密化 腫瘤基質(zhì)由細(xì)胞外基質(zhì)、脈管系統(tǒng)和癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）組成。PDAC與許多其他腫瘤的區(qū)別在于，圍繞惡性細(xì)胞的增生基質(zhì)占據(jù)了整個(gè)癌結(jié)節(jié)的80%，即所謂的“基質(zhì)致密化”。CAF是促成增生反應(yīng)中的主要效應(yīng)細(xì)胞，而胰腺星狀細(xì)胞是CAF的最重要來源［6］。在正常的胰腺組織中胰腺星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，而胰腺癌細(xì)胞則可以通過分泌細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的活性將其活化［7］。隨后，活化的胰腺星狀細(xì)胞會(huì)分泌基質(zhì)蛋白，大量的基質(zhì)不僅限制了免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，還會(huì)增加腫瘤內(nèi)部壓力，使得腫瘤內(nèi)微血管管徑及分布產(chǎn)生差異，最終減少血液灌注，營(yíng)造低氧微環(huán)境［7］。缺氧微環(huán)境可以通過低氧誘導(dǎo)因子-1a（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1a）激活胰腺星狀細(xì)胞，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［8］，而后者是抗程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）治療的關(guān)鍵障礙［9］。

因此，打破基質(zhì)的致密化將是PDAC免疫治療的重大突破口。不管是通過局灶性粘著斑激酶［10］、聚乙二醇化人重組透明質(zhì)酸酶［11］減輕TME纖維化程度，還是應(yīng)用維生素D受體配體［12］將活化的胰腺星狀細(xì)胞恢復(fù)為靜止?fàn)顟B(tài)阻礙腫瘤基質(zhì)的產(chǎn)生，均能有效地減輕TME基質(zhì)的致密程度，增加T細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而增強(qiáng)免疫治療的作用。TME中微血管被高度壓縮，在腫瘤內(nèi)分布也不均衡，先前的抗血管治療在臨床前和臨床研究中均未帶來明顯收益，因此萌生了“微血管正常化”的治療策略。通過阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子軸使腫瘤血管正?；梢愿纳浦芗?xì)胞覆蓋和腫瘤灌注，從而通過白細(xì)胞黏附分子的作用減少微環(huán)境缺氧程度，增加CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)［13］，增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效。

1.2 免疫抑制細(xì)胞 PDAC微環(huán)境另一特征為大量的免疫抑制細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫抑制細(xì)胞被招募到TME中的機(jī)制尚不清楚，但有研究顯示PDAC細(xì)胞可以產(chǎn)生高水平的細(xì)胞引誘劑C-X-C基序趨化因子配體10（CXCL10）、趨化因子配體5（CCL5）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來觸發(fā)免疫抑制細(xì)胞的浸潤(rùn)。TME中的免疫抑制細(xì)胞包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumorassociated macrophages，TAMs）、髓系來源抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）等。它們能夠通過抑制自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、T細(xì)胞等對(duì)腫瘤的殺傷功能，從而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此靶向消融免疫抑制細(xì)胞，將會(huì)減輕胰腺癌對(duì)免疫治療的耐藥性，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

在腫瘤組織中，巨噬細(xì)胞根據(jù)其功能可分為M1型和M2型。M1型是經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞，發(fā)揮炎癥反應(yīng)作用，殺傷腫瘤細(xì)胞；M2型是替代活化的巨噬細(xì)胞，抗原呈遞功能低下，參與誘導(dǎo)免疫抑制環(huán)境的形成，被稱為TAMs［14］。TAMs釋放的白介素10（Interleukin 10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等免疫抑制因子有助于Tregs募集，同時(shí)抑制NK細(xì)胞、DC、CD8+T細(xì)胞的活化，維持腫瘤的生長(zhǎng)和免疫逃逸［15］。因此在PDAC中靶向TAMs可改善對(duì)T細(xì)胞檢查點(diǎn)免疫療法的反應(yīng)。臨床前研究顯示抑制集落刺激因子-1（colony-stimulating factor 1，CSF-1）或集落刺激因子-1受體（colony-stimulating factor 1 receptor，CSF-1R）不僅導(dǎo)致TAMs耗竭，還對(duì)殘余TAMs進(jìn)行了重塑，從而促進(jìn)了抗原呈遞并增強(qiáng)了抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)［16］。

MDSCs是未成熟髓細(xì)胞的異質(zhì)群體，具有高度免疫抑制性。MDSCs本身具有占用抗原的能力，并將其呈現(xiàn)給T細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體I（major histocompatibility complex I，MHC I）類蛋白。然后這些蛋白質(zhì)可以通過抑制γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）來誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞中的免疫耐受性，允許腫瘤逃逸［17］。SIRET等［18］的研究結(jié)果表明，MDSCs顯示出強(qiáng)的抑制能力，其特征在于抑制效應(yīng)CD8+T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞死亡以及功能分子的產(chǎn)生［19］。編程性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面［20］，PD-L1與 PD-1相互作用將抑制T細(xì)胞的激活導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，因此抗PD-L1 / PD-1可以重新激活機(jī)體T細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫力。

Tregs是組成性表達(dá)CD25和轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3）的CD4+T細(xì)胞，它可以通過與NK細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）、DC相互作用來抑制適應(yīng)性免疫以及先天免疫。Tregs可直接產(chǎn)生免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，表達(dá)負(fù)共刺激分子細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、PD-1/PD-L1，通過攝取［17］IL-2來抑制腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞的功能，也可通過穿孔或顆粒酶B依賴性途徑直接殺死T細(xì)胞和APC。JANG等［21］研究顯示靶向Treg細(xì)胞可以增強(qiáng)DC細(xì)胞的免疫刺激潛力來促進(jìn)抗腫瘤免疫作用。ZHANG等［22］使用白喉毒素將小鼠微環(huán)境中的Tregs耗竭，卻得到了與預(yù)期相反的結(jié)果。究其原因可能是PDAC晚期Tregs耗盡后CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤作用被其他CD4+T細(xì)胞、MDSCs的代償性增加以及成纖維細(xì)胞種群的重編程所抵消導(dǎo)致的。

2 基因或表觀遺傳異常

PDAC患者中基因或表觀遺傳的異常將會(huì)直接影響到其對(duì)免疫治療的反應(yīng)性，同時(shí)也通過減少腫瘤特異性抗原的表達(dá)或呈遞，減少效應(yīng)T細(xì)胞的浸潤(rùn)間接影響免疫治療的有效性。例如，腫瘤細(xì)胞中PTEN基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）［23］的表達(dá)缺失，將會(huì)抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷作用，減少T細(xì)胞向腫瘤中浸潤(rùn)。若患者的腫瘤中富集某些基因的表達(dá)，并且這些基因?qū)筆D-1治療無反應(yīng)，稱為先天性抗PD-1抗性標(biāo)記。有很大一部分胰腺癌患者富含先天性抗PD-1抗性標(biāo)記，這或許就可以解釋為什么胰腺癌患者會(huì)對(duì)抗PD-1治療產(chǎn)生耐藥性。另外最近的研究表明［24］，在T細(xì)胞染色質(zhì)發(fā)生一系列遺傳和表觀遺傳改變后，活化T細(xì)胞核因子-T0X（nuclear factor of activated t cells-TOX，NFAT-TOX）軸上的基因被激活并導(dǎo)致反向重復(fù)（inverted repeats，IR）上調(diào)，效應(yīng)子功能喪失，最終導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭。當(dāng)DNA錯(cuò)配修復(fù)功能異常時(shí)，微衛(wèi)星的復(fù)制錯(cuò)誤無法糾正并且連續(xù)積累，使微衛(wèi)星序列長(zhǎng)度或堿基組成部分發(fā)生變化，這稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。然而微衛(wèi)星區(qū)域不穩(wěn)定/錯(cuò)配修復(fù)缺陷表型在PDAC中發(fā)生概率僅為0.8%［25］，所以在大部分接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑患者的總體生存時(shí)間及臨床控制率均無明顯提升。盡管如此，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）指南仍然建議對(duì)微衛(wèi)星區(qū)域不穩(wěn)定或錯(cuò)配修復(fù)缺陷進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，對(duì)測(cè)試呈陽性的患者，免疫抑制劑帕博利珠單抗（pembrolizumab）仍作為二線治療方案［26］。 研究發(fā)現(xiàn)，只有腫瘤內(nèi)具有較多數(shù)量的克隆源性新抗原的患者，才會(huì)對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療敏感［27］?；蛉笔?、突變或表觀遺傳變化會(huì)導(dǎo)致突變新抗原的表達(dá)喪失，躲避了機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊，從而獲得對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑和過繼性T細(xì)胞免疫的抗性［28］。腫瘤患者的T細(xì)胞可以破壞表達(dá)強(qiáng)腫瘤特異性突變抗原的腫瘤細(xì)胞，通過免疫選擇過程來塑造腫瘤免疫原性而留下表達(dá)較弱抗原或無能力的腫瘤細(xì)胞［29-30］。又或者，癌細(xì)胞可能具有腫瘤抗原，但存在抑制腫瘤抗原呈遞機(jī)制影響細(xì)胞毒性T細(xì)胞的識(shí)別，從而對(duì)免疫治療產(chǎn)生耐藥性。

因此通過對(duì)組織遺傳學(xué)的檢測(cè)，將會(huì)有助于明確患者是否存在耐藥的易感基因或者對(duì)免疫治療敏感的新抗原，從而有助于臨床醫(yī)生選擇合適的治療方案。

3 微生態(tài)

與正常人胰腺組織相比，PDAC患者表現(xiàn)出更豐富的微生物組［31］。研究者使用16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA）基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)人PDAC樣本中變形桿菌（45%），擬桿菌（31%）和硬毛菌（22%）含量最高。RIQUELME等［32］也利用16S rRNA基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，相比于短期生存時(shí)間的PDAC患者，具有長(zhǎng)期生存時(shí)間患者的腫瘤中具有豐富微生物多樣性，其中糖多孢菌、假黃單胞菌、鏈霉菌在腫瘤內(nèi)顯著富集。隨后又發(fā)現(xiàn)CD8+和GzmB+T細(xì)胞的組織密度與微生物菌群多樣性之間存在顯著的相關(guān)性，表明多樣性的腫瘤微生物，尤其是腫瘤中這三個(gè)種屬細(xì)菌可能通過招募和激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞改善抗腫瘤的免疫反應(yīng)。

Pushalkar和Riquelme均發(fā)現(xiàn)了腸道菌群可以定植到胰腺癌腫瘤內(nèi)而影響腫瘤細(xì)菌菌群組成。與對(duì)免疫治療產(chǎn)生反應(yīng)的患者相比，非反應(yīng)者的腸道、胰腺內(nèi)微生物組成具有一定的差異，這些菌株誘導(dǎo)耐受性免疫抑制的微環(huán)境，有利于癌癥的發(fā)展和對(duì)免疫療法的抵抗力?；蚪M鼠模型的研究很好地證明了微生物組在胰腺癌發(fā)展中的作用，具有異常腸道菌群小鼠的腫瘤微環(huán)境中纖維化的程度增加、腫瘤的發(fā)育出現(xiàn)異常［33］。Pushalkar發(fā)現(xiàn)由來自胰腺癌宿主的腸道細(xì)菌提取物夾帶的巨噬細(xì)胞阻止了CD4+T和CD8+T細(xì)胞的活化，并且暗示了巨噬細(xì)胞抗原呈遞能力的降低。Riquelme將用長(zhǎng)生存期患者的腸道菌群移植到胰腺癌模型小鼠上，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)生存期患者的糞便微生物可以有效的激活CD8+T細(xì)胞，顯著延長(zhǎng)小鼠的生存期。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌消融與TME的免疫原性重編程有關(guān)，包括MDSC減少、M1巨噬細(xì)胞分化和腫瘤內(nèi)T細(xì)胞活化顯著增加，最終減輕了KPC（LSL-KrasG12D/+；LSL-Trp53R172H/+；Pdx-1-Cre）小鼠腫瘤負(fù)擔(dān)。因此，用抗生素消融微生物組可重塑腫瘤的微環(huán)境，誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，改善免疫監(jiān)測(cè)，并提高對(duì)已建立腫瘤的免疫治療的敏感性。同時(shí)可以對(duì)胰腺癌患者微生物組成進(jìn)行基因檢測(cè)，可以將其作為對(duì)免疫療法反應(yīng)的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，指導(dǎo)更有效的治療方案。

4 總結(jié)與展望

多年來人們針對(duì)PDAC的免疫治療做出了大量的努力，但是其免疫治療的臨床療效仍然不理想。其臨床療效不佳的原因很大程度上是因?yàn)镻DAC具有高度增生的基質(zhì)，其間浸潤(rùn)著大量TAMs，MDSCs和Tregs等免疫抑制細(xì)胞，構(gòu)成了免疫治療的巨大障礙。同時(shí)PDAC是低免疫原性、低突變率、高腫瘤負(fù)荷的癌癥，三者均會(huì)造成腫瘤對(duì)免疫治療的低反應(yīng)性甚至不反應(yīng)。但是PDAC免疫治療的耐藥性機(jī)制至今仍不明確，這將是未來免疫治療的重點(diǎn)研究方向，明確其機(jī)制并且尋找相應(yīng)的對(duì)策能夠更好指導(dǎo)臨床上PDAC的治療。