局部缺血預(yù)處理腦保護(hù)分子機(jī)制的研究進(jìn)展

冉秋林 劉志剛

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院[北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院]， 北京 100000； 2. 泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院 心血管外科， 天津 300000)

1990年，Kitagawa等[1]每隔1天夾閉沙土鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈2 min進(jìn)行局部缺血預(yù)處理(local ischemic preconditioning, LIPC)，2次后閉塞雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min誘導(dǎo)全腦缺血性損傷，研究發(fā)現(xiàn)LIPC可完全防止全腦5 min缺血引起的海馬神經(jīng)元死亡。該研究首次描述了腦缺血耐受(ischemia tolerance, IT)現(xiàn)象，此后針對(duì)腦缺血性損傷的各種缺血預(yù)處理策略被廣泛研究，主要包括LIPC、遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理和使用物理刺激或藥物治療的交叉預(yù)處理[2-3]。本文就近年來(lái)LIPC腦保護(hù)分子機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期進(jìn)一步探索和優(yōu)化缺血預(yù)處理策略，改善缺血性腦血管病患者預(yù)后。

1 LIPC與血腦屏障

內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接和粘附連接對(duì)維持血腦屏障(blood brain barrier, BBB)的完整性至關(guān)重要，組成跨膜緊密連接和粘附連接的緊密連接蛋白Claudin-5和鈣粘蛋白Cadherin-5在LIPC后表達(dá)上調(diào)，并參與BBB細(xì)胞旁通透性的調(diào)節(jié)[4-5]。Yang等[6]使用7-0外科縫合線阻斷小鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈12 min以進(jìn)行LIPC，然后夾閉小鼠大腦中動(dòng)脈60 min誘導(dǎo)缺血性卒中(ischemic stroke, IS)，研究發(fā)現(xiàn)，LIPC后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)顯著激活，腦組織中Claudin-5和Cadherin-5表達(dá)顯著增加，內(nèi)源性IgG抗體通過(guò)微血管向腦實(shí)質(zhì)滲漏減少。然而，LIPC對(duì)Nrf2基因敲除小鼠的BBB無(wú)保護(hù)作用，表明Nrf2在LIPC介導(dǎo)的BBB保護(hù)中起關(guān)鍵作用。此外，Kim等[7]研究發(fā)現(xiàn)，LIPC可增強(qiáng)缺血腦的突觸可塑性、促進(jìn)緊密連接蛋白Claudin-5和occludin的表達(dá)、加強(qiáng)軸突生長(zhǎng)及髓鞘修復(fù)。緊密連接蛋白Claudin-5和occludin表達(dá)上調(diào)有助于腦新生血管形成，降低缺血后BBB的通透性[8]。由此可見(jiàn)，LIPC可在一定程度保護(hù)BBB免受缺血性損傷，還可促進(jìn)其損傷后修復(fù)。

2 LIPC與一氧化氮合酶

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶、神經(jīng)型一氧化氮合酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶三種亞型。張業(yè)貴等[9]研究發(fā)現(xiàn)，電針刺激預(yù)處理大鼠百會(huì)穴和大椎穴可顯著降低腦組織神經(jīng)型NOS和誘導(dǎo)型NOS的表達(dá)水平及神經(jīng)功能缺損評(píng)分，提高大腦缺血性損傷后皮層存活神經(jīng)元數(shù)目和膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)水平。Wang等[10]研究表明，LIPC可顯著提高大鼠6 min全腦缺血后海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元存活率，還可促進(jìn)鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ下游的突觸支架蛋白PSD95與內(nèi)皮型一氧化氮合酶結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶Ser847磷酸化，從而降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性，阻斷c-Jun磷酸化和Fas配體表達(dá)，發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。Greco等[11]向大鼠腹腔內(nèi)注射內(nèi)皮型NOS的相對(duì)選擇性抑制劑L-亞氨基乙基鳥氨酸或非選擇性NOS抑制劑亞硝基左旋精氨酸甲酯，15 min后將直徑0.37 mm的尼龍絲插入右側(cè)大腦中動(dòng)脈起始處，1 h后拔出以構(gòu)建缺血模型。該研究發(fā)現(xiàn)L-亞氨基乙基鳥氨酸可加重腦皮質(zhì)損傷，皮質(zhì)和紋狀體中白細(xì)胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)的mRNA水平升高，而亞硝基左旋精氨酸甲酯可減少腦皮質(zhì)損傷，不影響紋狀體和皮質(zhì)中IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)，僅增加紋狀體RAGE mRNA的表達(dá)。以上研究表明，LIPC的腦保護(hù)效應(yīng)與NOS活性下調(diào)有關(guān)，NOS相關(guān)信號(hào)通路是腦缺血性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

3 LIPC與谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1

大腦發(fā)生缺血性損傷后，谷氨酸(glutamic acid, Glu)在細(xì)胞外間隙不斷積聚。高水平的Glu可致興奮性毒性神經(jīng)元死亡，進(jìn)一步加劇腦損傷。LIPC可上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glutamate transporter-1, GLT-1)的表達(dá)，促進(jìn)Glu清除，因此具有神經(jīng)保護(hù)作用[12]。Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，LIPC可顯著上調(diào)大鼠腦組織p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和GLT-1的表達(dá)，增加Glu攝取活性，有效預(yù)防8 min全腦缺血后海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡。此外，p38 MAPK抑制劑SB203580和p38 MAPK反義寡核苷酸可抑制LIPC后海馬CA1區(qū)GLT-1上調(diào)，顯著增加海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失或固縮死亡，表明p38 MAPK的表達(dá)上調(diào)與GLT-1的神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)。Zhang等[14]研究表明，LIPC可增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)和GLT-1的表達(dá)，減輕致命性腦缺血后海馬神經(jīng)元損傷。免疫印跡和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，LIPC后星形膠質(zhì)細(xì)胞中PPARγ激活早于GLT-1上調(diào)。此外，PPARγ拮抗劑T0070907可顯著降低LIPC誘導(dǎo)的GLT-1上調(diào)及相關(guān)神經(jīng)保護(hù)作用，表明PPARγ參與了LIPC誘導(dǎo)IT過(guò)程中GLT-1的調(diào)控。Sun等[15]研究發(fā)現(xiàn)，LIPC可促進(jìn)大鼠海馬CA1區(qū)核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB) p50蛋白核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)p50/p65二聚體形成，提高NF-κB與DNA的結(jié)合活性，最終促進(jìn)GLT-1表達(dá)，減輕缺血性損傷后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元壞死。此外，應(yīng)用p38 MAPK抑制劑SB203580和NF-κB抑制劑BAY11-7082預(yù)處理可消除LIPC的上述效應(yīng)，提示LIPC是通過(guò)p38 MAPK/NF-κB分子信號(hào)通路上調(diào)GLT-1的表達(dá)，從而促進(jìn)Glu清除，最終防止腦缺血后興奮性毒性神經(jīng)元死亡。

4 LIPC與免疫調(diào)節(jié)

腦缺血后大量炎性細(xì)胞被招募至梗死區(qū)，進(jìn)而參與腦炎性損傷過(guò)程。在大鼠局灶性腦缺血模型中，LIPC可顯著抑制缺血后大腦半球細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和促炎轉(zhuǎn)錄因子等炎癥基因的表達(dá)，并阻止中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向同側(cè)皮質(zhì)浸潤(rùn)[16]。Pan等[17]研究表明，LIPC可縮小小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞后大腦半球梗死體積，促進(jìn)離體星形膠質(zhì)細(xì)胞Toll樣受體3(toll-likereceptor 3, TLR3)、p-NF-κB及干擾素β(interferon β，IFN-β)表達(dá)，減少IL-6分泌，還可提高離體星形膠質(zhì)細(xì)胞在12 h持續(xù)性氧糖剝奪后的存活率。此外，TLR3配體Poly I: C預(yù)處理同樣可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞IFN-β的表達(dá)，減輕離體星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，而TLR3抗體可抑制IFN-β表達(dá)，逆轉(zhuǎn)LIPC和Poly I: C誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，表明TLR3信號(hào)通路激活可抑制缺血后炎癥反應(yīng)，在LIPC誘導(dǎo)的IT過(guò)程中起重要作用。Hamner等[18]研究表明，LIPC可減輕氧糖剝奪對(duì)小鼠視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷及軸突完整性的破壞，促進(jìn)視神經(jīng)功能恢復(fù)。然而，LIPC在TLR4和I型干擾素受體基因敲除的小鼠中均未能誘導(dǎo)腦IT，證明LIPC誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用依賴于免疫信號(hào)分子TLR4和I型干擾素受體的表達(dá)。

5 LIPC與遺傳調(diào)控

5.1 表觀遺傳修飾

表觀遺傳修飾指在不改變潛在DNA序列的前提下基因表達(dá)調(diào)節(jié)的全過(guò)程，如組蛋白修飾、DNA甲基化和非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄[19]。在局灶性缺血模型中，抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；妇哂猩窠?jīng)保護(hù)作用已被證實(shí)[20]。Cai等[21]將涂有硅樹脂的單絲依次通過(guò)C57雄性小鼠的右側(cè)頸外及頸內(nèi)動(dòng)脈直至到達(dá)大腦中動(dòng)脈底部，然后閉塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈15 min以誘導(dǎo)IT，RNA序列分析、蛋白質(zhì)檢查及DNA甲基化分析表明，腦LIPC后大量神經(jīng)保護(hù)基因的調(diào)節(jié)區(qū)域發(fā)生去甲基化且基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成啟動(dòng)，其中Arid5a、Stc2和Nptx2被確定為L(zhǎng)IPC的誘導(dǎo)基因，它們?cè)谡{(diào)節(jié)區(qū)去甲基化后表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。

小泛素樣修飾物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)是一種參與翻譯后蛋白修飾的泛素樣蛋白，可在熱應(yīng)激、缺氧和冬眠等條件下激活并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。SUMO化修飾可促進(jìn)DNA末端運(yùn)動(dòng)，并直接影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、先天免疫與I型干擾素的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA轉(zhuǎn)錄及損傷修復(fù)過(guò)程[22-23]。敲除SUMO 1基因可加重缺血損傷，沉默SUMO 1可促進(jìn)Na+/Ca2+交換器亞型3降解，降低LIPC的保護(hù)作用[24]。Na+/Ca2+交換器亞型與離子通道、受體和其他離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有協(xié)同作用，Na+和Ca2+穩(wěn)態(tài)對(duì)維護(hù)線粒體功能、細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)及減輕缺血性神經(jīng)元損傷具有關(guān)鍵作用。因此，Na+/Ca2+交換器亞型3的SUMO化修飾可能是LIPC誘導(dǎo)的腦保護(hù)新靶點(diǎn)。

5.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

激活蛋白-1(activator protein 1, AP-1)是一種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，其與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域中的特定識(shí)別序列結(jié)合后參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[25]。Kapinya等[26]研究發(fā)現(xiàn)，LIPC可預(yù)防沙土鼠5 min全腦缺血后海馬CA1區(qū)延遲性神經(jīng)元死亡。此外，運(yùn)用電泳遷移率變動(dòng)分析法研究海馬CA1神經(jīng)元AP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA的結(jié)合活性變化，發(fā)現(xiàn)AP-1與DNA的結(jié)合活性在LIPC 1～3 h后呈線性增加，3 h出現(xiàn)短暫高峰，提示AP-1的早期激活參與了LIPC誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。Formisano等[27]研究發(fā)現(xiàn)，氧糖剝奪預(yù)處理可提高皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞3 h持續(xù)氧糖剝奪后的存活率，并可促進(jìn)Na+/Ca2+交換器亞型1的表達(dá)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子家族特異性蛋白1(specificity protein 1, Sp1)是Na+/Ca2+交換器亞型1基因的轉(zhuǎn)錄激活子，轉(zhuǎn)錄因子家族Sp3是Na+/Ca2+交換器亞型1的轉(zhuǎn)錄抑制因子。離體神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪預(yù)處理后，轉(zhuǎn)錄因子家族Sp1、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible facter-1, HIF-1)與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300共定位在Na+/Ca2+交換器亞型1基因的啟動(dòng)子上，參與Na+/Ca2+交換器亞型1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Xie等[28]用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑BIBR1532對(duì)離體神經(jīng)元進(jìn)行預(yù)處理，隨后對(duì)離體神經(jīng)元進(jìn)行缺氧缺糖處理，發(fā)現(xiàn)BIBR1532預(yù)處理可顯著增強(qiáng)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶與線粒體抗氧化基因啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)線粒體抗氧化基因的表達(dá)，顯著降低活性氧水平，增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)嚴(yán)重缺血缺氧誘導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激的耐受性，提高離體神經(jīng)元缺氧缺糖后的存活率。該研究結(jié)果表明，BIBR1532可通過(guò)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄重編程上調(diào)線粒體抗氧化基因的表達(dá)，改善腦缺血及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷。

6 LIPC與細(xì)胞能量代謝

LIPC可抑制缺血后糖酵解、ATP合成及能量消耗，減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷。Geng等[29]研究發(fā)現(xiàn)，LIPC可縮小腦缺血性損傷后梗死面積，改善細(xì)胞腫脹、核固縮和腦軟化等病理變化，降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分；代謝組學(xué)分析表明LIPC可抑制缺血后糖酵解，增加磷酸戊糖途徑流量并促進(jìn)β-羥丁酸的利用。此外，代謝關(guān)鍵基因和蛋白質(zhì)表達(dá)分析顯示，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3表達(dá)下調(diào)及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亞單位mRNA水平下降與LIPC誘導(dǎo)的代謝改變有關(guān)。Cho等[30]研究表明，LIPC顯著減少了大鼠全腦缺血5 min后海馬CA1區(qū)錐體層神經(jīng)元細(xì)胞死亡。此外，免疫組織化學(xué)染色顯示沙土鼠CA1區(qū)神經(jīng)元葡萄糖激酶和葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白的免疫反應(yīng)性在LIPC后顯著增強(qiáng)，提示LIPC后CA1區(qū)神經(jīng)元的存活可能與葡萄糖激酶和葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)有關(guān)。Baranovicova等[31]閉塞大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min進(jìn)行LIPC，48 h后閉塞雙側(cè)頸總動(dòng)脈15 min誘導(dǎo)缺血性損傷，再灌注24 min后血漿代謝物水平分析表明，LIPC組大鼠與缺血性損傷組大鼠的血漿酮體和葡萄糖水平均升高，糖酵解產(chǎn)物水平均降低，兩者無(wú)顯著差異，而LIPC組大鼠血漿肌酸水平顯著高于缺血性損傷組，提示LIPC通過(guò)增加肌酸水平促進(jìn)缺血性損傷后的代謝恢復(fù)。以上研究表明，深入研究LIPC中調(diào)控能量代謝相關(guān)的酶及信號(hào)通路可能有助于尋找缺血性卒中治療的潛在分子靶點(diǎn)。

7 展望

在復(fù)雜的腦血管手術(shù)中，LIPC易操作且具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，但倫理及安全因素限制了其臨床應(yīng)用。因此，進(jìn)一步探索和優(yōu)化缺血預(yù)處理策略十分必要。藥物交叉預(yù)處理策略具有耐受性好、創(chuàng)傷較小、有效且易于實(shí)施等優(yōu)點(diǎn)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。進(jìn)一步研究LIPC腦保護(hù)作用的分子機(jī)制可為交叉預(yù)處理相關(guān)腦保護(hù)藥物的研發(fā)和應(yīng)用夯實(shí)基礎(chǔ)。此外，目前停循環(huán)術(shù)后患者的腦永久性和暫時(shí)性神經(jīng)功能障礙發(fā)生率仍然較高，術(shù)中腦缺血可能是主要原因，將優(yōu)化的缺血預(yù)處理策略與深低溫停循環(huán)相結(jié)合應(yīng)用到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)甚至臨床中是一個(gè)新的研究方向，有望進(jìn)一步降低停循環(huán)術(shù)后神經(jīng)功能障礙的發(fā)生率，提高患者生活質(zhì)量。