非洲豬瘟病毒綜述

敖清瑩

（六盤水職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州六盤水 553000）

非洲豬瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)引起家豬和不同種類野豬的一種病毒性、急性出血熱。自1921年肯尼亞首次報道非洲豬瘟后，迅速擴(kuò)散至全球許多地區(qū)，如俄羅斯、高加索、東歐、加勒比和南美等地區(qū)。2018年我國遼寧沈陽首次發(fā)現(xiàn)該病，在之后的1年時間里，我國報告了160余起ASF疫情，共撲殺生豬119.3萬頭，養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失超過3億美元，對養(yǎng)殖業(yè)和食品安全行業(yè)造成了極大的威脅[1]。

1 非洲豬瘟的流行病學(xué)

1910年，Montgomery等[2]在肯尼亞發(fā)現(xiàn)1起野豬(主要是疣豬)不明原因死亡的疫情，經(jīng)過對病死豬的檢測分析，于1921年報道此疫情是由ASFV引起，幾年后，在南非進(jìn)行的研究證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，并證明了疣豬是非洲豬瘟病毒的宿主。此外，有人提出，軟蜱作為一個長期的宿主可以終身攜帶病毒，無需反復(fù)接觸病毒攜帶者。這不僅解釋了病毒從野豬向家豬傳播的機(jī)制，而且也解釋了該病為何突然在此前被宣布無病的地區(qū)出現(xiàn)。此后ASF疫情持續(xù)在非洲大陸傳播，主要集中在撒哈拉以南的非洲國家。

1957年，在西歐和拉美國家發(fā)現(xiàn)ASFV，且ASF第1次在非洲大陸以外的地區(qū)發(fā)生，經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)此次疫情傳播是由于養(yǎng)殖人員使用從安哥拉飛往里斯本航班產(chǎn)生的泔水飼喂豬群。經(jīng)過對疫區(qū)豬群的撲殺，疫情得到控制和根除。1960年，葡萄牙出現(xiàn)ASF疫情。美洲在20世紀(jì)60年代也報道過非洲豬瘟疫情，但在20世紀(jì)80年代被根除。2017年，在俄羅斯毗鄰中俄邊境地區(qū)發(fā)生非洲豬瘟疫情，2018年8月，非洲豬瘟疫情蔓延至我國。

目前，已確定了至少22種不同的ASFV基因型，每一種基因型在地理上都不是均勻分布的，對基因型分析的結(jié)果表明，1957年和1960年從非洲傳到葡萄牙的基因型屬于Ⅰ型病毒。2007年4月，在高加索地區(qū)靠近黑海港口波蒂的地區(qū)報道的非洲豬瘟疫情中的病毒屬于基因Ⅱ型。我國沈陽發(fā)生非洲豬瘟疫情后，研究人員對非洲豬瘟病毒的p72片段序列進(jìn)行基因型系統(tǒng)進(jìn)化分析，用CD2v片段序列進(jìn)行血清群的系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用MEGA 5.0軟件(https://www.megasoftware.net/)構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此次分離的毒株(China 2018/1)屬于基因Ⅱ型、血清8群，與格魯吉亞毒株(Georgia 2007/1)高度同源[3]。

2 非洲豬瘟病毒的病原學(xué)

2.1 非洲豬瘟病毒的分類

非洲豬瘟病毒最初被認(rèn)為是一種黏液病毒，隨后根據(jù)其衣殼的二十面體結(jié)構(gòu)，被歸入虹彩病毒科。然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在基因組結(jié)構(gòu)等幾個重要方面，ASFV與痘病毒更為相似。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，ASFV是位于痘病毒科和虹彩病毒科之間的一個獨(dú)立分支。2001年，該病毒第二次被重新歸類為非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是該科中已知的唯一成員[4]。目前，ASFV是唯一已知的真正的DNA蟲媒病毒。

2.2 非洲豬瘟病毒的基因分析

非洲豬瘟病毒是一種超大型線性的雙鏈DNA病毒，病毒粒子結(jié)構(gòu)為二十面體，直徑大約為200 nm。根據(jù)病毒分離株的不同，基因組大小約為170～190 kbp，編碼 151～167個開放閱讀框 (Open reading frame,ORF)，目前，這些基因的功能大多數(shù)還是未知?；蚪M的末端包含反向互補(bǔ)的發(fā)夾環(huán)，與串聯(lián)反向重復(fù)序列(Tandem inverted repeats,TIR)相鄰，這與痘病毒DNA結(jié)構(gòu)極度相似；在基因組中間有著一段長約125 kbp的ASFV基因組保守區(qū)，其兩側(cè)為數(shù)個多基因家族(Multigene families,MGF)組成的可變區(qū)。ASFV分離株基因組長度的不同可能是由于TIRs數(shù)量的差異，而變異主要是由于幾個多基因家族(MGF100、110、300、360和505/530)的ORF減少或增加造成[5]。此外，一些不屬于MGFs的基因，如DP96R和E66L，表現(xiàn)出不同的分離特異性存在，這2個基因在Ba71V毒株中存在，但在Malawi Lil20/1毒株中不存在。

2.3 非洲豬瘟病毒的蛋白結(jié)構(gòu)

非洲豬瘟病毒粒子包括至少68個蛋白，排列成4個同心結(jié)構(gòu)域，依次為內(nèi)核、核心、內(nèi)包膜和衣殼。在蛋白衣殼下面是內(nèi)部脂質(zhì)膜，最初人們認(rèn)為這是一種雙膜結(jié)構(gòu)。Farlow等[6]使用新型電子顯微鏡檢測方法，發(fā)現(xiàn)ASFV的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池塌陷形成了單一脂質(zhì)雙分子層。由E183L基因編碼的p54結(jié)構(gòu)蛋白存在于內(nèi)膜中，被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜塌陷機(jī)制的重要因素。B646L基因產(chǎn)物p72蛋白占病毒粒子質(zhì)量的1/3，被認(rèn)為是主要的衣殼蛋白。2個多聚蛋白pp220和pp62的蛋白產(chǎn)物形成一個大約30 nm大小的蛋白層被稱為核衣殼，這些蛋白產(chǎn)物占病毒粒子質(zhì)量的32%。多聚蛋白的裂解是由病毒蛋白酶pS273R完成的，該蛋白酶也位于核衣殼中。內(nèi)核是一個直徑約80 nm的密集區(qū)域，包含病毒基因組、核蛋白、RNA聚合酶和早期轉(zhuǎn)錄因子。此外，每個病毒粒子在通過質(zhì)膜出芽時獲得外部包膜[7]。研究人員利用質(zhì)譜分析[8]，鑒定出23個迄今未檢測到的病毒蛋白，它們功能未知，但占病毒顆粒中存在蛋白的34%。此外，一些新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)蛋白在ASFV病毒粒子中大量存在。如pM1249L、pCP123L、pC129R、pC717R、pI177L，每個蛋白占病毒蛋白的含量超過1%。此外，科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)了許多與病毒粒子相關(guān)的宿主蛋白，大多數(shù)是典型的質(zhì)膜蛋白或與皮質(zhì)肌動蛋白細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白。

3 非洲豬瘟病毒的感染機(jī)制

3.1 非洲豬瘟病毒感染途徑假說

非洲豬瘟病毒在機(jī)體內(nèi)和機(jī)體外均表現(xiàn)出對單核巨噬細(xì)胞系細(xì)胞的嗜性，為了感染豬體，病毒需要與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合，越過質(zhì)膜進(jìn)入相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)開始復(fù)制。因而，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被認(rèn)為是非洲豬瘟病毒進(jìn)入豬體的主要途徑，然而具體的細(xì)胞內(nèi)受體尚未明確。一些研究將非洲豬瘟病毒入侵與靶細(xì)胞表面受體聯(lián)系起來，包括CD203a+、豬CD163、CD45和MHC-Ⅱ[8]。雖然這些分子可能扮演受體的角色，但仍然不清楚它們是否對感染至關(guān)重要。隨著時間的推移，對非洲豬瘟病毒入侵的多項研究均揭示了其感染過程中對發(fā)動蛋白和網(wǎng)格蛋白的依賴性，并認(rèn)為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是最有可能的進(jìn)入機(jī)制[9]。非洲豬瘟病毒進(jìn)入的速度很快，病毒顆粒感染后1～15 min即可在豬的細(xì)胞核內(nèi)檢測到。此外，非洲豬瘟病毒進(jìn)入豬體細(xì)胞還依賴膽固醇，藥物誘導(dǎo)去除或打亂質(zhì)膜上的膽固醇能夠抑制非洲豬瘟病毒的感染。

3.2 非洲豬瘟病毒在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制

盡管關(guān)于非洲豬瘟病毒入侵存在多種理論，但乃有通過內(nèi)吞途徑的病毒才能產(chǎn)生感染。在內(nèi)吞途徑中，腔內(nèi)酸化是病毒脫殼的必要條件，內(nèi)吞途徑完整性的喪失，抑制非洲豬瘟病毒的早期核內(nèi)體成熟為晚期核內(nèi)體，導(dǎo)致感染率下降。衣殼脫殼后，病毒內(nèi)膜與核內(nèi)體膜融合，并將病毒核心粒子送入細(xì)胞質(zhì)，病毒到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后會轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核周區(qū)的微管組織中心(Microtubule organizing center,MTOC)附近進(jìn)行病毒的復(fù)制，這一過程依賴于結(jié)構(gòu)蛋白p54和動力蛋白之間的相互作用，以促進(jìn)沿微管網(wǎng)絡(luò)的運(yùn)輸。待非洲豬瘟病毒完成復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯后，結(jié)構(gòu)蛋白、病毒膜、不成熟和成熟病毒粒子以及包藏在波形蛋白中的病毒DNA在病毒工廠組裝形成子病毒；成熟的病毒顆粒通過pE120R衣殼蛋白和肌動蛋白從病毒工廠運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜，隨后病毒粒子通過質(zhì)膜出芽的方式從細(xì)胞中釋放出來[10]。

3.3 非洲豬瘟病毒在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄

非洲豬瘟病毒基因的表達(dá)在病毒復(fù)制周期中，因感染時間的不同被分為最早期、早期、中期和晚期等4個階段。瞬時的早期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是在環(huán)己酰亞胺存在下合成的，不需要蛋白參與。早期轉(zhuǎn)錄對DNA合成抑制劑不敏感，而中期和晚期轉(zhuǎn)錄恰恰相反。非洲豬瘟病毒轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制開始時觀察到的病毒感染早期基因表達(dá)下降密切相關(guān)。非洲豬瘟病毒粒子包含足夠的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，至少有20個基因，可以合成成熟的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄開始于每個基因上游富含AT的啟動子序列[11]。相比之下，非洲豬瘟病毒與大多數(shù)病毒一樣，完全依賴宿主翻譯機(jī)制來生產(chǎn)病毒蛋白，感染導(dǎo)致宿主翻譯復(fù)合物eIF4F組裝增加。

4 非洲豬瘟的臨床癥狀和病理變化

了解疾病的病程變化對早期的診斷和防控有重要作用。研究表明，非洲豬瘟的感染潛伏期、臨床癥狀和病理變化因感染毒株、感染途徑、感染劑量及宿主體況等的不同而不同，主要病理變化為脾臟敗血性出血和淋巴結(jié)出血性炎癥，組織學(xué)病變見大量淋巴細(xì)胞凋亡。豬感染非洲豬瘟病毒后的臨床癥狀具體分為最急性、急性、亞急性和慢性4種。

4.1 最急性癥狀

一般來說，強(qiáng)毒株會導(dǎo)致最急性的非洲豬瘟癥狀，其特征是非常迅速的臨床病程，高燒(高達(dá)42℃)、厭食、嗜睡，有時無疾病跡象猝死。此外，由于高熱會引起呼吸道損壞，但通常在剖檢時沒有發(fā)現(xiàn)明顯的損傷[12]。

4.2 急性癥狀

高等或中等毒力的非洲豬瘟病毒毒株會導(dǎo)致急性癥狀，發(fā)病豬的臨床特點(diǎn)是高燒、體溫40～42℃，嗜睡、厭食和不活動。感染豬往往聚集在一起，并且耳部、尾部、腹部和肛周出現(xiàn)向心性發(fā)紺。在高致病性毒株感染中，通常可見發(fā)病豬呼吸困難，伴有嚴(yán)重的肺水腫；皮膚存在點(diǎn)狀出血或瘀斑；其他臨床癥狀還有流鼻涕且有時帶血(鼻出血)、嘔吐和腹瀉，嘔吐物和糞便也可帶血(黑變)。懷孕母豬一般在發(fā)病7 d內(nèi)會發(fā)生流產(chǎn)，感染豬場的豬死亡率可能高達(dá)100%。剖檢可見急性非洲豬瘟最典型的病變是出血性脾臟腫大，此外，還有多灶性出血性淋巴結(jié)炎，淋巴結(jié)發(fā)生廣泛出血，形成大理石樣外觀。受影響最嚴(yán)重的淋巴結(jié)為肝胃淋巴結(jié)、腎淋巴結(jié)及腹部淋巴結(jié)(如回腸淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié))。下頜骨淋巴結(jié)、咽后淋巴結(jié)或腹股溝淋巴結(jié)等也可觀察到較少的出血。腎臟表面和切面?？梢婞c(diǎn)狀出血。也可觀察到其他病變，多見黏膜或其他臟器漿膜出血，如大腸、小腸、心外膜、膀胱等黏膜出血[13]。

4.3 亞急性癥狀

被中毒力非洲豬瘟病毒毒株感染的豬通常會出現(xiàn)亞急性臨床癥狀，其臨床癥狀與急性非洲豬瘟的癥狀相似。受感染豬乃表現(xiàn)為中、高熱，死亡率為30%～70%，感染后能夠存活7～20 d。亞急性期病豬的血管變化主要是出血和水腫，可能比急性期更嚴(yán)重。受感染豬的死亡發(fā)生在2個不同的階段，一是在最初的血小板減少和白細(xì)胞減少期間，另一個是“恢復(fù)”階段，在感染仔豬中能觀察到血管舒張引起的紅細(xì)胞膨出。在病例剖檢中，病豬表現(xiàn)為心包積液、腹水和多灶性水腫。一些病豬可能出現(xiàn)出血性脾臟腫大，還有病豬出現(xiàn)部分脾臟腫大，脾臟斑塊受影響，其他部位不受影響。非洲豬瘟亞急性癥狀還包括多灶性出血性淋巴結(jié)炎，即可觀察到病豬全身多個淋巴結(jié)出血和“大理石”花紋；腎臟可見點(diǎn)狀出血；肺臟多灶性肺炎，肺呈斑片狀實(shí)變，顏色較深。這種病變也可歸因于非洲豬瘟病毒誘導(dǎo)的免疫抑制引起的繼發(fā)性感染。

4.4 慢性癥狀

慢性非洲豬瘟是低等毒力毒株引起的，主要表現(xiàn)為患病豬關(guān)節(jié)炎、呼吸困難和皮膚壞死。據(jù)推測，這種低等毒力毒株和相關(guān)的慢性病毒，是20世紀(jì)60年代伊比利亞半島疫苗試驗(yàn)使用的非洲豬瘟病毒分離株進(jìn)化而來的。在非洲豬瘟病毒已存在很長時間的其他地區(qū)，高等毒力和中等毒力分離株的進(jìn)化并沒有導(dǎo)致慢性癥狀。在慢性非洲豬瘟病豬中未觀察到血管改變，能觀察到的病變與細(xì)菌繼發(fā)感染、誘導(dǎo)纖維性多漿膜炎、壞死或慢性肺炎、皮膚、舌頭和扁桃體壞死有關(guān)[14]。

5 非洲豬瘟疫苗

研究人員對非洲豬瘟疫苗的研究經(jīng)歷了從滅活疫苗、重組蛋白/多肽疫苗、DNA疫苗到基因缺失疫苗的發(fā)展歷程。但目前仍沒有有效、安全的非洲豬瘟疫苗上市，非洲豬瘟病毒基因組和蛋白的復(fù)雜性是影響疫苗研發(fā)的主要因素。亞單位疫苗需要先確定潛在的保護(hù)性抗原，研究發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒的p30/CP204L、p54/E183L和CD2v/EP402R等基因的重組蛋白對病毒抗原具有部分保護(hù)作用。Salguero[15]從HEK-293T細(xì)胞中成功純化出5種非洲豬瘟病毒抗原，并將其構(gòu)建到重組經(jīng)修飾痘苗病毒安卡拉(MVA)病毒載體中，通過對豬的安全性和免疫原性試驗(yàn)，首次證明了從哺乳動物細(xì)胞中純化的非洲豬瘟病毒亞單位抗原以及在MVA載體中表達(dá)的非洲豬瘟病毒亞單位抗原是安全的，并且可以在豬的初始增強(qiáng)免疫方案中誘導(dǎo)非洲豬瘟病毒特異性抗體和T細(xì)胞反應(yīng)。

隨著對非洲豬瘟病毒編碼基因功能的深入研究，通過靶向基因缺失來生產(chǎn)理想的弱毒非洲豬瘟疫苗成為可能。研究表明，缺失I型干擾素抑制基因的非洲豬瘟弱毒疫苗可以誘導(dǎo)豬體細(xì)胞產(chǎn)生免疫保護(hù)[16]，這些基因的缺失并不會影響病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，所以能夠在不斷培養(yǎng)中獲得相應(yīng)基因缺失的弱毒株，但其免疫豬乃后均出現(xiàn)不同程度的副作用，免疫豬主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、跛行。此外，研究還表明，同時缺失9GL和MGF360/505基因可使得非洲豬瘟病毒格魯吉亞毒株(Georgia 2007/1)毒力大幅度降低，但是用其接種豬并不能對親代病毒的攻擊提供保護(hù)[17]。因此，尋找其他的靶基因來生產(chǎn)有效和安全的非洲豬瘟疫苗，仍需要對病毒調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答的分子機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)且深入研究。