益生菌對斷奶仔豬腸道黏膜屏障功能的調(diào)控作用及可能機制

劉偉鑫，張佳鑫，陳繼發(fā)

（宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，江西省高等學校硒農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，江西宜春 336000）

仔豬早期斷奶技術可以提高豬場生產(chǎn)效率，但因仔豬消化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，固體飼料對腸道的摩擦增加了腸道上皮細胞脫落，破壞腸道結構，進而降低仔豬對飼糧養(yǎng)分的消化率；同時仔豬腸道屏障功能尚未完善，容易受到病原微生物侵襲，造成腸道菌群紊亂，增加腸道通透性，繼而引發(fā)一系列危害（Zheng等，2021）。目前，我國已全面禁止在動物飼糧中添加促生長類抗生素，飼用抗生素替代品的研究是動物營養(yǎng)與飼料科學領域研究的熱點。益生菌因具有安全、綠色、高效等特點而引起廣泛關注。研究表明，益生菌能夠維持腸道菌群平衡（Liang等，2021；Shin等，2019），保護腸黏膜結構（Han等，2020；Hu等，2018），調(diào)節(jié)腸道免疫功能（Fu等，2021；Zhang等，2010），提升腸道健康水平（Betancur等，2020；Wu等，2018），進而可降低斷奶應激對其生長性能造成的負面影響。本文綜述了益生菌對斷奶仔豬腸道健康影響的研究成果，總結了其調(diào)控斷奶仔豬腸道屏障功能的分子機制，以期為通過營養(yǎng)調(diào)控方式改善斷奶仔豬腸道健康提供理論依據(jù)。

1 益生菌對斷奶仔豬腸道機械屏障的調(diào)控作用

機械屏障是腸道重要的基礎屏障，由黏液凝膠層、腸上皮細胞及細胞間的多種連接等組成。緊密連接是腸上皮細胞間重要的連接方式，主要由閉鎖蛋白（occludin）、閉合蛋白（claudins）、閉合小環(huán)蛋白（ZO-1）和連接黏附分子等組成，對維持腸上皮細胞極性及調(diào)節(jié)腸道通透性具有重要作用。研究表明，益生菌可通過促進緊密連接蛋白表達、改善腸道形態(tài)結構、降低腸道通透性等途徑維護斷奶仔豬腸道機械屏障。

1.1 益生菌對斷奶仔豬腸道形態(tài)結構的影響腸道絨毛位于小腸上皮和固有層向腸腔隆起的指狀突起，不僅具有吸收養(yǎng)分的作用，且絨毛擺動還能將病原微生物推開，有效過濾有害因子。研究表明，飼糧添加丁酸梭菌（Han等，2020）、凝結芽孢桿菌（Wu等，2018）、假絲酵母菌（Zhaxi等，2020）、枯草芽孢桿菌（Ding等，2021）等能夠顯著增加斷奶仔豬小腸絨毛高度、降低隱窩深度，提高絨毛高度/隱窩深度值。另外，在產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）攻毒下，斷奶仔豬小腸絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著提高，且絨毛高度/隱窩深度值顯著降低（柳成東等，2021；Becker等，2020）。而在飼糧中添加凝結芽孢桿菌或口服屎腸球菌NCIMB 10415（王茹，2018）均能夠顯著緩解ETEC誘導的斷奶仔豬腸黏膜結構損傷。

綜上，益生菌可改善斷奶仔豬腸道形態(tài)結構，其可能作用機制如下：（1）與致病菌競爭黏附位點，抑制致病菌對腸道上皮的黏附和定植，進而減少腸黏膜損傷；（2）代謝產(chǎn)生有機酸，降低腸道酸度，抑制病原微生物繁殖，有些短鏈脂肪酸如丁酸還可為腸上皮細胞損傷修復供能。

1.2 益生菌對斷奶仔豬腸道緊密連接蛋白表達的影響 仔豬斷奶應激和受到ETEC 等病原微生物侵襲均會降低腸道緊密連接蛋白的表達（李?；ǖ?，2021），而在飼糧中添加益生菌可以顯著改善這種情況。研究表明，給斷奶仔豬每天口服2 mL（1×108cfu/mL）乳酸菌（Hu等，2018）或飼喂含5×1010cfu/kg 羅伊氏乳桿菌LR1 的飼糧（Yi等，2018）或飼喂含1×108cfu/kg 丁酸梭菌ZJU-F1 的飼糧（Fu等，2021）均能夠顯著上調(diào)腸道緊密連接蛋白ZO-1 的表達。在對ETEC 攻毒斷奶仔豬的研究發(fā)現(xiàn)，直接飼喂解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌混合制劑，可顯著上調(diào)回腸occludin、ZO-1 mRNA 表達量（Betancur等，2020）；灌服含3×109cfu 屎腸球菌菌液顯著提高了回腸claudin-1 mRNA 表達水平（王茹，2018）。另外，體外試驗發(fā)現(xiàn)，用植物乳桿菌處理感染ETEC 的豬腸上皮細胞，ZO-1 和occludin mRNA 表達量在6、24 h 顯著上調(diào)（李?；ǖ龋?021）；研究指出，羅伊氏乳桿菌可能通過調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）信號通路而提高斷奶仔豬腸上皮細胞中ZO-1 和occludin 的表達（Yi等，2018）。

綜上，益生菌能夠上調(diào)腸道緊密連接蛋白的表達，維持腸道屏障結構完整性，其可能作用機制如下：（1）干預核轉錄因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，降低細胞內(nèi)細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 MAPK 的磷酸化水平，重建促炎因子和抗炎因子間的平衡，緩解促炎因子對緊密連接蛋白如occludin 等基因轉錄、翻譯及蛋白質(zhì)修飾過程造成的不利影響（劉磊等，2020）；（2）激活p38 MAPK 和ERK 信號通路，使緊密連接復合體重組，促進緊密連接蛋白的表達（Dai等，2011）。

1.3 益生菌對斷奶仔豬腸道通透性的影響 斷奶應激會損壞仔豬腸道屏障功能，增加腸道通透性，引發(fā)致病菌及毒素“移位”。通常腸黏膜屏障受損時，腸道通透性增加，D-乳酸、內(nèi)毒素、二氨氧化酶大量釋放至血液中。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加乳酸菌（Hu等，2018）、丁酸梭 菌ZJU-F1（Fu等，2021）、凝結芽孢桿菌（Wu等，2018）可以顯著降低斷奶仔豬血清內(nèi)毒素、D-乳酸含量或二氨氧化酶活性，說明益生菌對斷奶應激引發(fā)的仔豬腸道通透性增加具有良好改善作用。

2 益生菌對斷奶仔豬腸道化學屏障的調(diào)控作用

腸道化學屏障主要由腸上皮細胞分泌的黏液、消化液以及腸腔內(nèi)正常寄生菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)構成，具有抵御病原微生物對腸道上皮的侵襲等作用。研究表明，益生菌可通過促進杯狀細胞分泌黏蛋白（MUCs）、維持胃腸道最適pH 和增加短鏈脂肪酸產(chǎn)量等途徑調(diào)節(jié)腸道化學屏障功能。

2.1 益生菌對斷奶仔豬腸道黏蛋白表達的影響斷奶應激和受到ETEC 等病原微生物的侵襲都會降低斷奶仔豬腸道黏蛋白的分泌，而益生菌可促進黏蛋白的表達。研究發(fā)現(xiàn)，給斷奶仔豬飼喂含丁酸梭菌ZJU-F1 或丁酸梭菌ZJU-F1 與地衣芽孢桿菌混合飼糧，腸道黏蛋白（MUC1、MUC4 和MUC20）mRNA 表達水平顯著增加（Fu等，2021）；給宮內(nèi)發(fā)育遲緩斷奶仔豬飼喂添加解淀粉芽孢桿菌的飼糧可顯著緩解回腸黏膜MUC2 含量降低的現(xiàn)象（Li等，2018）。Mao 等（2016）研究表明，在輪狀病毒攻毒斷奶仔豬飼糧中添加鼠李糖乳桿菌GG 可顯著提高腸道MUC1、MUC2 的含量，有效緩解仔豬腹瀉癥狀。

益生菌促進腸道黏蛋白分泌的可能機制如下：（1）代謝產(chǎn)生或促進短鏈脂肪酸的分泌，而短鏈脂肪酸如丁酸可以特異性識別MUC2 啟動子內(nèi)的scfa 響應區(qū)域和順式元件AP1，誘導啟動子激活，促進啟動子組蛋白H3 和H4 的乙?；约癕UC2 啟動子H3 的甲基化，進而上調(diào)MUC2 基因表達（Xiao等，2021）；（2）促進免疫細胞分泌白細胞介素（IL）-4、IL-13 等細胞因子，激活MAPK信號通路，上調(diào)MUC2 的表 達（Iwashita等，2003）。

2.2 益生菌對斷奶仔豬腸道pH、短鏈脂肪酸含量的影響 哺乳期間由于乳汁發(fā)酵產(chǎn)生乳酸可一定程度上維持仔豬胃腸道的酸性環(huán)境，斷奶后胃腸道乳酸含量降低，且僅有的少量乳酸被飼糧蛋白質(zhì)等緩沖，使得斷奶仔豬消化道pH 升高，影響消化酶的分泌及活性。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加1.0 g/kg復合益生菌（植物乳桿菌、戊糖片球菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和酵母菌及其培養(yǎng)物）能夠顯著降低斷奶仔豬空腸和十二指腸pH（陳振等，2017）；添加植物乳桿菌顯著降低了斷奶仔豬盲腸和結腸pH，顯著提高了盲腸和結腸中丁酸、乳酸的含量（李雪莉，2017）；Fu 等（2021）報道，給斷奶仔豬飼喂含丁酸梭菌ZJU-F1 或丁酸梭菌ZJU-F1 與地衣芽孢桿菌混合飼糧顯著提高了仔豬盲腸丁酸、丙酸、乙酸和總酸水平。

3 益生菌對斷奶仔豬腸道微生物屏障的調(diào)控作用

3.1 益生菌對斷奶仔豬腸道菌群結構及微生物多樣性的影響 仔豬由哺乳期過渡到斷奶期腸道菌群結構發(fā)生變化，微生物多樣性降低（Frese等，2015）。研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門、厚壁菌門和軟壁菌門是斷奶仔豬的主要細菌門，給斷奶仔豬飼喂含5×108cfu/kg 丁酸梭菌的飼糧，腸道微生物ACE 和Chao 指數(shù)顯著升高，巨球型菌屬、瘤胃菌科NK4A214 和普雷沃氏菌科UCG-003 相對豐度顯著增加，而瘤胃菌科_UCG-005 相對豐度顯著降低（Liang等，2021）；Yang 等（2021）報道，口服假絲酵母菌及其培養(yǎng)物顯著提高了斷奶仔豬盲腸乳酸桿菌科和瘤胃球菌科相對豐度。Shin 等（2019）研究表明，飼糧添加植物乳桿菌JDFM LP11 顯著提高了斷奶仔豬糞便菌群α 多樣性，顯著提高了厚壁菌門和螺旋體門相對豐度；Wang 等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，給斷奶仔豬飼喂地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌混合液，顯著提高了腸道菌群Simpson 指數(shù)，增加了擬桿菌門和瘤胃球菌科相對豐度，降低了布勞特氏菌屬和梭菌屬相對豐度。上述研究表明，飼糧添加益生菌能夠改善斷奶仔豬腸道菌群結構，提高腸道微生物多樣性。

3.2 益生菌對斷奶仔豬腸道特定微生物的影響研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加凝結芽孢桿菌顯著增加了斷奶仔豬結腸雙歧桿菌數(shù)量（Fu等，2021）；添加丁酸梭菌和糞腸球菌顯著提高了斷奶仔豬腸道丁酸梭菌含量（Wang等，2019）；添加枯草芽孢桿菌DSM32315 顯著增加了仔豬回腸芽孢桿菌和雙歧桿菌數(shù)量（Tang等，2019）；給斷奶仔豬連續(xù)1 周灌胃1×1011cfu/mL 鼠李糖乳桿菌顯著增加了糞便乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，顯著降低了糞便大腸桿菌數(shù)量（Li等，2012）。此外，益生菌對ETEC誘發(fā)的斷奶仔豬腸道菌群紊亂有顯著調(diào)節(jié)作用。Pan 等（2017）研究表明，ETEC 攻毒下斷奶仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量顯著增加，乳酸桿菌數(shù)量顯著減少，而補飼地衣芽孢桿菌和釀酒酵母可與ETEC競爭腸黏膜黏附位點，競爭性排除ETEC，顯著提高腸道乳酸桿菌數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量；師麗剛（2020）報道，給ETEC 攻毒斷奶仔豬飼喂復合益生菌制劑（乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸糞球菌、酵母菌）顯著降低了仔豬腸道大腸桿菌含量，提高了乳酸桿菌和雙歧桿菌含量。

上述研究表明，益生菌能夠調(diào)節(jié)斷奶仔豬腸道微生物平衡，其可能作用機制如下：（1）與致病菌競爭黏附位點和有機底物，抑制或阻斷病原菌的黏附和定植（Pan等，2017）；（2）與致病菌爭奪腸腔內(nèi)養(yǎng)分和氧氣，抑制其生長繁殖，促進有益菌增殖；（3）代謝產(chǎn)生的細菌素、有機酸等物質(zhì)可直接殺滅或抑制致病菌（Wang等，2018）。

4 益生菌對斷奶仔豬腸道免疫屏障的調(diào)控作用

4.1 益生菌對斷奶仔豬腸道炎性因子表達的影響 Fu 等（2021）研究表明，丁酸梭菌ZJU-F1 可通過調(diào)節(jié)Toll 樣受體（TLR）2/髓樣分化因子88（MyD88）/NF-κB 信號通路，顯著提高抗炎因子（IL-4、IL-10）mRNA 表達水平，促進抗菌肽的分泌，激活腸道特異性免疫；Wang 等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，給斷奶仔豬飼喂添加丁酸梭菌或糞腸桿菌的飼糧，空腸TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白的表達量顯著降低。Fu 等（2021）報道，飼糧添加凝結芽孢桿菌顯著降低了斷奶仔豬腸道IL-1β 和TNFα mRNA 表達水平。Shin 等（2019）通過回腸RNA測序發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼喂添加植物乳桿菌JDFM LP11 的飼糧后，回腸免疫相關基因（BPI、RSAD2、SLPI、LUM、OLFM4、DMBT1 和C6）表達量顯著下調(diào)，表明腸道炎癥減輕。另外，益生菌對致病菌、脂多糖（LPS）誘發(fā)的斷奶仔豬腸道促炎因子異常表達具有顯著抑制作用，能降低腸道炎癥反應。Wang 等（2019）報道，添加丁酸梭菌和糞腸球菌可以顯著降低LPS 應激下斷奶仔豬空腸TLR4、MyD88、NF-κB 的蛋白表達水平，表明其可能通過調(diào)節(jié)TLR4 信號通路緩解LPS 誘導的炎癥反應。Li 等（2012）研究表明，鼠李糖乳桿菌顯著降低了大腸桿菌K88 引起的斷奶仔豬空腸TLR4、IL-8 和回腸β-防御素2 mRNA 表達水平的顯著提高。另外，Qiao 等（2020）體外研究發(fā)現(xiàn)，唾液乳桿菌可通過阻斷NF-κB、MAPK 信號通路來抑制IL-1β、IL-8 和TNF-α 的產(chǎn)生，緩解大腸桿菌k88誘導的IPEC-J2 細胞炎癥反應。

綜上所述，益生菌可通過干預TLR/NF-κB 或MAPK 信號通路，調(diào)節(jié)炎性因子表達，緩解斷奶仔豬腸道炎癥，其可能作用機制如下：益生菌可降低腸道大腸桿菌、沙門氏菌等致病菌數(shù)量，減少LPS產(chǎn)生；而致病菌、LPS 分別是TLR2、TLR4 免疫監(jiān)視的主要對象，這意味著與TLR 特異性結合的配體減少，進而TLR 被激活的概率降低，最終其下游信號通路受到抑制。

4.2 益生菌對斷奶仔豬腸道免疫球蛋白和抗菌肽含量的影響 益生菌可促進斷奶仔豬腸道免疫球蛋白和抗菌肽的分泌，增強腸黏膜免疫。Wang等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，植物乳酸桿菌可通過識別TLR2，激活ERK1/2、JNK 和c-jun/c-fos 信號通路，誘導斷奶仔豬腸道宿主防御肽（HDP）的表達和分泌。研究指出，斷奶仔豬口服2×108cfu/mL 乳酸桿菌（Hu等，2018）或飼喂添加5×1010cfu/kg羅伊氏乳桿菌LR1 的飼糧（Yi等，2018），顯著提高了腸道分泌型免疫球蛋白A（sIgA）含量。另外，Zhang 等（2010）研究表明，口服鼠李糖乳桿菌能顯著提高ETEC 攻毒下斷奶仔豬空腸和回腸sIgA濃度，改善腸道免疫性能。綜上，益生菌可通過調(diào)控免疫相關信號通路、調(diào)節(jié)腸道免疫因子表達、促進sIgA 和抗菌肽分泌等途徑維護斷奶仔豬腸道免疫屏障。

5 小結

益生菌對致病菌、LPS、輪狀病毒等病原體攻毒下斷奶仔豬腸黏膜屏障具有顯著保護作用；同時，添加益生菌能夠改善斷奶仔豬腸道形態(tài)結構，促進腸上皮細胞緊密連接蛋白和黏蛋白表達，調(diào)節(jié)腸道菌群結構，增強腸黏膜免疫，是一種有效的斷奶仔豬腸道健康調(diào)節(jié)劑。但目前益生菌對斷奶仔豬腸道屏障功能的調(diào)控機制還有待深入研究，可借助現(xiàn)代分子生物學和多組學技術研究益生菌調(diào)節(jié)腸黏膜屏障的分子機制。還可深入探討其對機體養(yǎng)分代謝的影響與腸道菌群的內(nèi)在聯(lián)系，亦可研究益生菌及其代謝產(chǎn)物對仔豬腸道菌群的調(diào)控與腸黏膜免疫的互作機制。此外，新型益生菌制劑的開發(fā)、益生菌的配比應用以及益生菌代謝產(chǎn)物的定點追蹤與宿主細胞功能之間的聯(lián)系仍將是今后研究的重點。