豬瘟活疫苗效力檢測方法的研究進展

陳建凱 張 璞 齊冬梅 賴月輝 侯高偉 周曉敏 吳浩平 曾垠濤

（1佛山科學技術(shù)學院，廣東佛山 528225；2廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 510530）

豬瘟（Classical swine fever,CSFV）又稱為古典豬瘟，早期被養(yǎng)豬界稱為豬霍亂（Hog cholera,HC）。該病是由家豬或野豬感染豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）后發(fā)生豬群相互傳播的疾病，也是流行范圍非常廣的一種動物傳染病，該病曾在世界上許多國家和地區(qū)廣泛流行和傳播。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）也將其列為A類16種法定傳染病之一。豬瘟是給我國養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失的一種非常嚴重的傳染病，我國一直非常注重豬瘟的防控，《中華人民共和國動物防疫法》將豬瘟列為一類傳染病。仔豬通常更易感染此病，免疫功能不全的發(fā)病癥狀更嚴重，患病豬一般表現(xiàn)為發(fā)熱、出血，體溫升高至41℃，有的患病豬體溫甚至達到了42.2℃，而且高熱稽留，癥狀維持數(shù)天。該病常常造成養(yǎng)豬場的豬只大批死亡，死亡率高達80%～90%。目前，疫苗免疫仍是預防豬瘟蔓延的有效手段，豬瘟疫苗的效價是否合格也是免疫成敗的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)通過介紹豬瘟活疫苗的效力檢測方法的研究進展，為檢測豬瘟疫苗，確保豬瘟疫苗產(chǎn)品穩(wěn)定性提供參考。

1 豬瘟病毒和豬瘟活疫苗簡介

按照國際學術(shù)界對豬瘟病毒的認知，國際病毒分類委員會（ICTV）將CSFV劃分屬于黃病毒科，瘟病毒屬，并且與之同屬的病毒還有牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）和邊界病毒（Border disease virus,BDV）。CSFV是一種包裹囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]，該病毒的基因組全長是12.3 kb，含有一個大的開放閱讀框，并且具有高度保守的5’和3’端非編碼區(qū)，該病毒的閱讀框是負責編碼3 898個氨基酸的多聚蛋白，這種多聚蛋白在細胞蛋白酶和病毒特異性蛋白酶的作用下，產(chǎn)生裂解，裂解以后，產(chǎn)生4個該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、E1、E2）和8個非結(jié)構(gòu)蛋白 （Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B），尤其是E2蛋白，此蛋白是誘導宿主產(chǎn)生中和抗體的主要免疫原，在設計能區(qū)分感染與接種動物（Differentiability of infected fron vaccinated animals，DIVA）的疫苗上被廣泛應用。該病毒粒子的直徑為40～50 nm，呈球形，有二十面體對稱的核衣殼，病毒粒子具有脂蛋白囊膜，囊膜表面上有6～8 nm的纖突，浮密度為1.15～1.16 g/mL，等電點4.8，沉降系數(shù)為140～180 S。電子顯微鏡下觀察可以看到病毒粒子表面不規(guī)則的纖突結(jié)構(gòu)。CSFV的存活力比較強，能夠在50℃環(huán)境中存活3 d，37℃環(huán)境中可存活7 d。CSFV能在豬原代細胞和傳代細胞上復制、繁殖，但不引起細胞病變（CPE）。

CSFV只有一個血清型，但分離到不少變異毒株。當前我國使用最廣泛的是豬瘟兔化弱毒疫苗。1954年，我國科學家周泰沖等成功研制出豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV），并被世界許多國家使用，普遍反映我國研制的豬瘟兔化弱毒疫苗效果較好。該疫苗的毒株被國際上公認為標準弱毒株，稱為中國疫苗株（C株）。2008年，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所寧宜寶等聯(lián)合廣東永順生物制藥股份有限公司成功研制出豬瘟兔化弱毒傳代細胞疫苗，疫苗效價高、免疫原性好、對豬的保護力強，而且采用豬睪丸細胞（ST）培養(yǎng)，降低了用牛睪丸細胞培養(yǎng)可能造成BVDV污染的風險，該豬瘟疫苗的問世為我國乃至世界豬瘟防控做出了新的貢獻。

2 豬瘟活疫苗效力檢測方法

2.1 兔體定型熱反應檢測法

該方法是現(xiàn)行的《中華人民共和國獸藥典》[2]中明確的豬瘟活疫苗檢測的方法。兔體定型熱反應檢測法從20世紀50年代建立并沿用至今，也是目前我國使用最為經(jīng)典的豬瘟活疫苗檢測方法。每批豬瘟活疫苗經(jīng)稀釋后接種健康的新西蘭大耳白兔，每只兔經(jīng)耳緣靜脈注射1 mL，然后每隔6 h進行體溫測定，繪制體溫曲線，計算出每頭份RID含量。該方法比在豬活體免疫攻毒的方法簡單，但仍受到兔子個體差異、飼養(yǎng)環(huán)境、接種應激等方面的影響，導致檢測成本比較高，檢測試驗周期性較長，檢測結(jié)果穩(wěn)定性較差，可重復性較差。因此，該方法檢測豬瘟活疫苗的弊端也日益顯現(xiàn)，隨著時代的發(fā)展和科學技術(shù)的進步，將會有新的檢測方法補充或替代。

2.2 ELISA檢測法

ELISA檢測法是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測豬瘟病毒的最常用方法。也可用于規(guī)?；B(yǎng)豬場豬瘟抗體的監(jiān)測。對豬瘟活疫苗系列稀釋后接種豬睪丸細胞（ST）所收獲的待檢樣品，采用抗原捕獲ELISA檢測試劑盒，樣品中的豬瘟疫苗弱毒抗原被捕獲，捕獲的豬瘟疫苗弱毒抗原由瘟病毒特異性抗體（Erns）和辣根過氧化物酶標記物來檢測。未結(jié)合的酶標記物被洗掉，再加入底物和色原體溶液。在酶的存在下，底物轉(zhuǎn)化為可以與色原體發(fā)生反應的產(chǎn)物。采用ELISA方法進行豬瘟活疫苗效力檢測。ELISA檢測法的優(yōu)點是不需要提取豬瘟病毒RNA，操作簡單，而且該方法具有較高的敏感性和特異性。但是試劑盒的價格比較高。而且疫苗接種ST細胞后，第一次收獲病毒液效價不穩(wěn)定，二收、三收的病毒效價比較穩(wěn)定。王海光等[3]采用抗原捕獲ELISA法檢測不同稀釋濃度的豬瘟活疫苗中活病毒感染細胞后增殖出的子代病毒量，通過計算豬瘟活疫苗病毒的最高細胞感染劑量，建立豬瘟活疫苗效力檢測方法。

2.3 間接免疫熒光法 （IFA）

CSFV在敏感性細胞（如ST細胞、PK細胞等）內(nèi)生長不會引起細胞病變，顯微鏡下觀察組織切片也不能看到明顯的病變。因此可以采用間接免疫熒光（IFA）的方法檢測豬瘟疫苗毒。間接免疫熒光法是采用一種抗原的抗體（或者稱之為一抗），然后進行細胞孵育的時候發(fā)生結(jié)合，并且能夠與對應一抗（或者稱之為抗一抗）的抗體（可稱為二抗，二抗上具有能夠偶聯(lián)的熒光素分子）和細胞孵育相結(jié)合，最后借助熒光顯微鏡進行觀察判定。通過將豬瘟活疫苗稀釋后，接種到豬睪丸細胞（ST）中，經(jīng)培養(yǎng)、固定、洗脫、抗體結(jié)合后，在熒光顯微鏡下觀察，如果含有豬瘟疫苗毒，則會看到細胞內(nèi)及細胞周圍有亮綠色的熒光，可判為陽性。根據(jù)稀釋濃度及陽性率計算豬瘟活疫苗的效價。間接免疫熒光檢測法的優(yōu)點是試驗結(jié)果直觀，易于判斷。缺點是疫苗毒接種細胞后培養(yǎng)時間長，導致檢測周期長，需要專業(yè)能力較高的人員進行操作。而且，目前間接免疫熒光的方法多數(shù)為自建方法，不同廠家生產(chǎn)的熒光抗體等試劑差異較大，導致檢測結(jié)果不穩(wěn)定。

2.4 實時熒光定量PCR檢測法

實時熒光定量PCR（Real time fluorogenetic quan-titative PCR,FQ-PCR）檢測法是把PCR技術(shù)與熒光化學檢測技術(shù)進行結(jié)合，并且在PCR反應體系中添加能夠產(chǎn)生熒光特性的物質(zhì)，這種熒光物質(zhì)在PCR反應過程之前不產(chǎn)生熒光，當PCR反應持續(xù)進行，熒光信號就以特異方式被激發(fā)。熒光定量PCR是最敏感和最特異性的抗原檢測方法。近年來，實時熒光定量PCR以靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優(yōu)點，在傳染病的檢測以及其他定量方面得到了較好的應用。而且這種方法應用于檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的效價，在我國也可以查到相關(guān)的論文。陳玉棟[4]等運用熒光定量PCR檢測方法對豬瘟兔化弱毒疫苗進行檢測，并與兔體定型熱法比較，分析并驗證了兔體定型熱檢測豬瘟兔化弱毒活疫苗與熒光定量PCR檢測豬瘟兔化弱毒活疫苗之間具有良好的相關(guān)性。蔣春燕[5]等將熒光定量PCR技術(shù)與ABI定量檢測系統(tǒng)相結(jié)合，建立了豬瘟病毒實時熒光定量PCR快速檢測技術(shù)，檢測豬瘟活疫苗弱毒，效果良好。上述介紹的研究，能夠看到熒光定量PCR檢測豬瘟活疫苗效價具有很好的應用前景。

3 檢測豬瘟病毒方法與特點

目前檢測豬瘟病毒抗原的方法主要是熒光定量PCR、ELISA抗原捕獲法和間接免疫熒光技術(shù)。熒光定量PCR反應靈敏，如果操作不當，可造成假陽性；ELISA抗原捕獲法避免了提取RNA的操作，但所用的試劑盒價格較高，且大多數(shù)依賴進口；間接免疫熒光（IFA）試驗周期較長，而且熒光顯微鏡下觀察結(jié)果時容易受到個人主觀因素影響。

4 小結(jié)

隨著科技的進步和行業(yè)的發(fā)展，尤其病毒學、獸醫(yī)學和分子生物學的飛速發(fā)展。豬瘟活疫苗采用兔體定型熱法進行效力檢測的各種局限性越來越明顯，因此，研究新型豬瘟活疫苗效力檢測方法，探索實時熒光定量PCR、ELISA抗原捕獲法、間接免疫熒光（IFA）等現(xiàn)代分子生物學檢測技術(shù)，使得豬瘟活疫苗效力檢測更準確、更方便快捷。先進的豬瘟病毒檢測方法可以確保豬瘟活疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量，節(jié)省豬瘟活疫苗生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)成本，提高疫苗生產(chǎn)效率具有重要的意義。