非洲豬瘟病毒PCR檢測在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的應(yīng)用

劉 敏

（廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北廊坊 065000）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的一類急性、熱性和高度接觸性傳染病，該病毒屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的一種雙股DNA病毒，其至少能夠編碼34種結(jié)構(gòu)蛋白，并且這些蛋白在傳代后發(fā)生變異的概率非常大，給后期的疫苗研制以及疫情防控造成了較大的難度。生豬感染非洲豬瘟后會有較明顯的臨床反應(yīng)，主要表現(xiàn)為體溫明顯升高，皮膚充血嚴重，患豬出現(xiàn)水腫，臟器出血，妊娠期的母豬還會出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等情況，患病豬的死亡率可高達100%，被我國列為一類動物疫病，同時世界動物衛(wèi)生組織（OIE）也將其列為必須上報的動物性疫病[1]。自1909年該病在肯尼亞被首次報道后，開始在非洲各國流行，隨后逐漸向世界范圍內(nèi)擴散，2018年非洲豬瘟首次在我國發(fā)生，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的打擊。至今為止，非洲豬瘟已經(jīng)在非洲、亞洲以及歐美等多個國家和地區(qū)流行，由于其高傳播性、高致病性以及高致死率等特點，該病受到了世界各國的高度重視。非洲豬瘟的防控形勢非常嚴峻，只有在養(yǎng)殖過程中建立一種快速、靈敏、準確性以及特異性均比較好的檢測方法，才能為更好地預(yù)防該病提供條件。

1 非洲豬瘟的病原特點

非洲豬瘟病毒顆粒的直徑在175～215 nm之間，為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，病毒表面具有囊膜，基因組的大小為170～190 kb，為雙股線狀DNA。該病毒可以通過多種途徑傳播，主要以接觸性傳播為主，可以從感染豬只的血液、臟器以及組織液或其他排泄物中分離出來，患病豬以及隱性帶毒豬為該病的主要傳染源，通常情況下，感染豬只在發(fā)病前的1～2 d即可通過口、鼻、咽喉等進行排毒。非洲豬瘟病毒可在無光照且低溫環(huán)境下的血液中存活6年之久，在正常的室溫中可以存活幾周，對高溫較為敏感，在55℃的環(huán)境中經(jīng)過30 min即可被滅活，在60℃的環(huán)境下6 min即可被殺滅。

2 非洲豬瘟的檢疫現(xiàn)狀

當(dāng)前，尚未出現(xiàn)特異性治療非洲豬瘟的方法，各大養(yǎng)殖企業(yè)主要采取各種預(yù)防措施，降低該病的發(fā)生，以減少該病所帶來的損失，防止非洲豬瘟病毒的輸入成了防控的重中之重。其中，動物及其相關(guān)產(chǎn)品的檢驗檢疫就成為了第一道防線。首先，各國均根據(jù)相應(yīng)的法律法規(guī)對進出口產(chǎn)品進行嚴格的檢驗檢疫。其次，各大養(yǎng)殖企業(yè)在引進生豬時進行嚴格的非洲豬瘟病毒檢驗檢疫，包括豬肉、相關(guān)肉制品、凍精液或胚胎卵源等。在生豬養(yǎng)殖過程中，通過對各個環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒的檢測，做到及時預(yù)警、及時防控，從而降低該病毒傳入豬場的概率，對生豬產(chǎn)業(yè)的安全養(yǎng)殖具有非常重要的意義。在檢測非洲豬瘟病毒方面需要建立一種敏感性高、特異性強的檢測方式來提高整個檢測過程的效率。當(dāng)前能夠檢測診斷非洲豬瘟病毒的方法較多，包括：動物接種試驗、紅細胞吸附試驗、免疫電泳試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、直接或間接免疫熒光試驗以及間接酶聯(lián)免疫蝕斑試驗和PCR試驗等，除PCR試驗以外的診斷方式對試驗室以及操作條件的要求相對較高，并且較為復(fù)雜，耗時較長，同時大多會涉及到活病毒的應(yīng)用，具有一定的危險性。而PCR試驗的敏感性以及特異性均比較高，且不會涉及到活病毒的應(yīng)用，適用于疑似病例的診斷檢測，可以用于養(yǎng)殖場內(nèi)大規(guī)模的病例篩查，是當(dāng)下非洲豬瘟診斷較為推崇的一種檢測方式。近年來，隨著檢測技術(shù)的不斷進步又出現(xiàn)了一種新型PCR技術(shù)——實時熒光定量PCR（Real-time PCR），與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，實時熒光定量PCR的優(yōu)點是適用范圍更為廣泛，2種PCR檢測方法的靈敏度及結(jié)果的可靠性均較高。

3 實時熒光定量PCR技術(shù)的原理

傳統(tǒng)常規(guī)的PCR技術(shù)主要是通過質(zhì)粒DNA模板進行PCR擴增，得到其循環(huán)反應(yīng)的終產(chǎn)物，然后對其進行定量和定性分析，這種技術(shù)無法對起始的模板進行準確的定量，因此無法對擴增反應(yīng)進行實時檢測。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，實時熒光定量PCR技術(shù)，通過在PCR的反應(yīng)體系中加入熒光基團，既可以根據(jù)熒光信號的變化來實時檢測PCR擴增反應(yīng)過程中的每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物準確的量變，還可以通過將Ct值與標準曲線的比對進行分析，即對起始模板進行準確的定量分析。

4 實時熒光定量PCR技術(shù)在非洲豬瘟檢測中的應(yīng)用

4.1 樣品的采集

對于活豬可以無菌條件下采集EDTA抗凝血樣品或者采集口、鼻拭子等樣品置于pH值為7.2的PBS緩沖液中保存；對于病死豬則可以在無菌條件下采集肝臟、脾臟和淋巴組織等樣品；對于環(huán)境樣品主要采集病豬活動過的圈舍墻面、地面、飼槽、水槽以及豬場內(nèi)的土壤和污水等；對于運輸?shù)能囕v應(yīng)采集車頭、車尾輪胎以及車廂內(nèi)的樣品等[2]；同時，還應(yīng)對養(yǎng)殖場以及飼料廠在生豬不同生長階段的飼料樣品進行采集并進行檢測。

4.2 檢測的儀器及試劑

4.2.1 PCR檢測所需儀器

在進行實時熒光定量PCR試驗之前應(yīng)準備好以下儀器：4℃冰箱和-80℃冰箱、可加熱的混勻儀、電子天秤、高壓蒸氣滅菌鍋、耐高壓離心管、一套1～1 000 μL的微量加樣器、帶濾芯的加樣器吸頭、超凈工作臺、生物安全柜、高速臺式冷凍離心機、超聲波水浴儀、實時熒光定量PCR儀、全自動核酸提取儀、電熱恒溫水浴槽、國產(chǎn)普通離心機等。當(dāng)前生產(chǎn)PCR試驗儀器的廠家較多，有多種國產(chǎn)和進口的產(chǎn)品可以選擇，實驗室可根據(jù)自身實際條件選擇儀器，并明確其生產(chǎn)廠家[2]。

4.2.2 PCR試驗的試劑與耗材

在進行PCR試驗前應(yīng)提前準備好專用的工作服、工作鞋以及工作帽等，并提前對試驗環(huán)境做好紫外線照射消毒，以免造成污染，導(dǎo)致試驗失敗。提前準備好一次性手套和吸水紙、可移動的紫外燈等。準備好需要檢測的非洲豬瘟病毒相關(guān)基因的引物、SYB green反應(yīng)體系，如果直接購買非洲豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒操作會更簡單。

4.3 檢測方法

在檢測非洲豬瘟病毒時，嚴格按照購買的非洲豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒說明書的操作步驟進行[3]。

4.4 結(jié)果判定

進行實時熒光定量PCR試驗應(yīng)同時設(shè)置陰性和陽性對照組，通過對比Ct值與標準曲線，可以發(fā)現(xiàn)陽性對照組的Ct值＜35，并且會有特異性的擴增曲線出現(xiàn)，而陰性對照組應(yīng)該無Ct值出現(xiàn)或Ct值≥40；同時，陰性對照組沒有特異性擴增曲線出現(xiàn)，表示試驗的結(jié)果是可靠有效的。此時，若檢測樣品的Ct值＜40，同時出現(xiàn)了特異性擴增曲線，則可判定為陽性。若被檢測的樣品沒有Ct值或Ct值≥40，則可以判定該樣品為陰性[3]。

4.5 試驗結(jié)果及常見的問題分析

現(xiàn)階段，基層獸醫(yī)實驗室利用實時熒光定量PCR檢測等方法在養(yǎng)殖場內(nèi)開展大規(guī)模病原學(xué)檢測的活動較少。由于基層獸醫(yī)缺乏試驗經(jīng)驗或試驗條件有限等因素限制，檢測結(jié)果經(jīng)常會出現(xiàn)試驗不成立、易出現(xiàn)假陽性或假陰性，重復(fù)組試驗結(jié)果不同等問題。

4.5.1 試驗不成立

試驗不成立主要表現(xiàn)為2種情況，一是陽性對照組無曲線或者Ct值＞35，這可能與陽性對照樣品的反復(fù)凍融有關(guān)系。二是陰性對照組Ct值＜40，這可能與實驗室的環(huán)境有關(guān)系，在試驗前未進行徹底的消毒或在試驗過程中的人為操作不規(guī)范造成污染等。

4.5.2 假陽性

檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性可能與檢測區(qū)域設(shè)置不合理、樣品提取人員操作及試劑配制等未在超凈臺或生物安全柜中進行，操作方法不規(guī)范或核酸發(fā)生氣溶膠污染、試驗結(jié)束后未進行徹底消毒等有關(guān)系[4]。

4.5.3 假陰性

檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性的情況主要可分為樣品問題和人為因素等2方面，一是樣品問題，如果在采血過程使用EDTA抗凝血管，則可能會出現(xiàn)肝素抑制PCR的反應(yīng)，而采集的樣品過少則可能使得EDTA全血溶液濃度太大，對試驗造成干擾，而出現(xiàn)假陰性。Ct值＞35的檢測樣品在很大程度上會受到環(huán)境、試驗操作手法等的影響。此外，樣品保存的時間也對結(jié)果有較大影響，樣品保存時間過長則非常容易導(dǎo)致假陰性。二是人為因素，主要是試驗員在試驗操作過程中的問題，例如少加樣品、漏加樣品重復(fù)檢測以及人工標記信號對熒光信號造成干擾等。

4.5.4 重復(fù)檢測結(jié)果不一致

造成重復(fù)檢測結(jié)果不一致的主要原因可能與檢測試劑反復(fù)凍融、樣品前處理時未離心，或未混勻?qū)е虏《镜姆植疾町?、混合的樣品量太大及溶血樣品中血紅素的含量存在較大差異等有關(guān)。

5 實時熒光定量PCR試驗時的注意事項

5.1 提高人員操作標準性

進行PCR試驗操作的人員應(yīng)該熟練掌握PCR的原理、操作方法和步驟，并且按照相關(guān)的操作規(guī)程與標準嚴格進行試驗操作，注重每一步的操作細節(jié)，如提前做好實驗室的滅菌處理，加樣加液時小心勻漿，防止產(chǎn)生氣溶膠等，避免由于試驗操作不規(guī)范導(dǎo)致試劑樣品污染，造成試驗結(jié)果有誤差。

5.2 提高生物安全規(guī)范性

對檢測非洲豬瘟病毒的PCR試驗應(yīng)使用認證合格的儀器進行檢測，不同的設(shè)備與儀器不可混用，在進行試驗前實驗室環(huán)境與生物安全柜等至少要進行30 min的紫外照射消毒。試驗結(jié)束后應(yīng)對操作臺及試驗用具等使用75%的酒精等化學(xué)制劑消毒，對生物安全柜進行10 min以上的通風(fēng)，并對環(huán)境進行30 min的紫外照射消毒。試驗過程中所使用的試劑、產(chǎn)生的廢料等應(yīng)分別放置到相應(yīng)的回收處，有專人保管，由生物安全公司進行統(tǒng)一處理。此外，二級實驗室不具有保存非洲豬瘟病毒的條件，應(yīng)當(dāng)天檢測后對樣品進行及時的高壓滅菌處理[5,6]。

6 小結(jié)

綜上所述，實時熒光定量PCR檢測技術(shù)的靈敏度較高，并且特異性較強，可以廣泛應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖企業(yè)對非洲豬瘟病毒的排查以及患病豬群的疫情檢測。但應(yīng)注意試驗操作的規(guī)范性，避免因為人為操作不規(guī)范、試劑儀器及試驗環(huán)境等因素對試驗結(jié)果的準確性造成影響。