非洲豬瘟病毒的研究進(jìn)展概述

楊大賀 白銀玉 方耀輝 盧富山*

（1河南普愛(ài)飼料股份有限公司，河南周口 466000；2中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，湖北武漢 430000）

1 非洲豬瘟病毒基因組研究進(jìn)展

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）是一種形態(tài)大型、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雙鏈DNA病毒，屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬。該病毒的不同毒株基因組長(zhǎng)度介于170～193 kb之間，是一種線性雙股DNA分子，具有151～190個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open reading frame,ORF）[1]。病毒的基因組是由左側(cè)可變區(qū)（40 kb）、中央保守區(qū)（125 kb）、右側(cè)可變區(qū)（20 kb）及37個(gè)核苷酸組成的共價(jià)閉合發(fā)夾環(huán)等組成[2]。

目前，全球已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少24種非洲豬瘟病毒的基因型，并已經(jīng)在烏干達(dá)、波蘭、法國(guó)等分離得到了不同毒力的毒株[3]。非洲豬瘟病毒基因Ⅰ型毒株在20世紀(jì)50～90年代的西班牙、葡萄牙等國(guó)家流行傳播，但最新的研究表明其首次入侵中國(guó)，并可以引起豬的慢性感染發(fā)病[4]。而非洲豬瘟病毒基因Ⅱ型毒株是主要流行于歐洲國(guó)家的與格魯吉亞疫情同源株。在病毒基因組中，P54和P72蛋白的編碼基因結(jié)構(gòu)保守，可以作為PCR診斷鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建[5]。在數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有ASFV基因組中找到127對(duì)等位基因，以這些基因?yàn)榛A(chǔ)對(duì)武漢地區(qū)的2株病毒序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其與2018年在東北發(fā)生疫情的非洲豬瘟病毒序列親緣關(guān)系較近[6]。因此，通過(guò)等位基因?qū)ふ曳侵挢i瘟病毒的特異性遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，將有助于臨床診斷及疫苗候選靶點(diǎn)的篩選。

2 非洲豬瘟病毒的結(jié)構(gòu)生物學(xué)

非洲豬瘟病毒粒子是正二十面體的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，被單一脂雙層組成大的囊膜包裹，病毒的直徑介于175～215 nm，在電鏡下呈六邊形，有50多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[7]。該病毒成熟后，可分為5個(gè)部分（由外至內(nèi)）：囊膜、衣殼、雙層內(nèi)膜、核衣殼和基因組[8]。

近年來(lái)，隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，非洲豬瘟病毒粒子的晶體結(jié)構(gòu)得到了深度解析。我國(guó)科研團(tuán)隊(duì)率先在我國(guó)分離出非洲豬瘟病毒流行株，并且解析了病毒4.1埃的三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡揭示病毒粒子由17 280個(gè)蛋白組成，包括1個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白（p72）和4個(gè)次要衣殼蛋白（M1249L、p17、p49、H240R）。其中，p72位于外層衣殼，由4個(gè)蛋白亞基ER1-ER4組成，可能會(huì)成為未來(lái)疫苗研發(fā)的靶點(diǎn)[9]。高福團(tuán)隊(duì)通過(guò)解析ASFV的DNA合成關(guān)鍵酶dUTP焦磷酸酶（E165R）的相關(guān)晶體結(jié)構(gòu)，包括apo-E165R和E165R-dUMP復(fù)合體，有望為研發(fā)靶向E165R的抗病毒藥物提供理論基礎(chǔ)[10]。近期，多個(gè)病毒關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)被解析，如p15、p72等，這些蛋白的解析為疫苗研發(fā)提供了重要的理論支撐[11-13]。

3 非洲豬瘟病毒的感染致病機(jī)制

非洲豬瘟病毒根據(jù)毒力的不同，可分為高致病性毒力、中等毒力、低毒力和無(wú)癥狀感染毒株。病毒感染后能夠由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入單核巨噬細(xì)胞，通過(guò)溶酶體系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，之后在宿主細(xì)胞質(zhì)中完成病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。病毒復(fù)制周期的完成需要以下幾個(gè)步驟：附著、內(nèi)化、基因組增殖、病毒組裝與釋放等過(guò)程[14]。盡管已經(jīng)提出了受體介導(dǎo)的巨胞飲和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式入侵宿主細(xì)胞，但是病毒如何借助受體進(jìn)入細(xì)胞仍不清楚。通過(guò)特異性抑制劑處理巨噬細(xì)胞后，ASFV的入侵和p32的表達(dá)均受到影響，證明了病毒的感染路徑[15]。

近期，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所非洲豬瘟病毒研究團(tuán)隊(duì)取得了一系列重要科研進(jìn)展，為新型非洲豬瘟疫苗的研發(fā)提供了重要理論依據(jù)。在病毒致病力研究方面，非洲豬瘟多基因家族蛋白pMGF505-7R能夠影響非洲豬瘟病毒的致病力，主要是通過(guò)抑制白細(xì)胞介素（1L-1β）和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生進(jìn)而影響病毒致病力。通過(guò)敲除MGF505-7R基因，構(gòu)建的重組病毒能夠誘導(dǎo)更高水平的IL-1β和IFN-β的產(chǎn)生，這表明pMGF505-7R能夠抑制IL-1β和I型干擾素的產(chǎn)生。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)構(gòu)建缺失MGF505-7R基因的重組非洲豬瘟病毒，發(fā)現(xiàn)缺失型病毒對(duì)仔豬的致病力降低，感染豬只的血清中IL-1β和IFN-β的蛋白水平升高，而組織器官的病毒載量顯著降低[16]。而Li等[17]研究表明，ASFV MGF505-7R通過(guò)抑制JAK1和JAK2介導(dǎo)的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控病毒毒力。MGF360-12L蛋白能夠顯著抑制IFN-β和NF-κB的轉(zhuǎn)錄和啟動(dòng)子活性[18]。這些研究成果揭開(kāi)了非洲豬瘟病毒免疫逃逸的面紗，為非洲豬瘟病毒的致病機(jī)制研究和疫苗的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

非洲豬瘟病毒的感染性顆粒結(jié)構(gòu)得到解析，但是大多數(shù)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的定位及功能有待被揭示。研究首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒的結(jié)構(gòu)蛋白pH240R能夠影響病毒粒子的組裝，從而降低子代病毒粒子的感染能力[19]。在細(xì)胞凋亡或焦亡方面，科研人員發(fā)現(xiàn)了非洲豬瘟病毒的pE199L基因與細(xì)胞凋亡相關(guān)，揭示了其通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡[20]；病毒編碼的一種半胱氨酸蛋白酶pS273R能夠結(jié)合細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白（Gasdermin D,GSDMD），并切割其G107-A108位點(diǎn)，阻礙細(xì)胞焦亡的發(fā)生，幫助病毒完成宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過(guò)程，表明該蛋白在炎癥反應(yīng)和病毒復(fù)制中具有重要的作用[21]。因此，對(duì)病毒入侵、增殖等過(guò)程的研究，將有助于深入解析病毒的感染致病機(jī)制。

4 非洲豬瘟疫苗的研究進(jìn)展

雖然目前仍沒(méi)有能在生產(chǎn)中使用的非洲豬瘟疫苗，但是，科研方面已經(jīng)有了一定的突破[22,23]。病毒DNA結(jié)合蛋白作為病毒毒力調(diào)節(jié)、復(fù)制轉(zhuǎn)錄的重要因子，使其成為疫苗研究的有效靶點(diǎn)。pA104R蛋白是在不同毒株中高度保守的，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示其與變形菌和陸生菌的DNA結(jié)合蛋白類似[24]。使用ASFV重組蛋白或者表達(dá)的病毒蛋白作為免疫原，免疫效果不佳，甚至產(chǎn)生降低了免疫反應(yīng)[25]。通過(guò)篩選一些藥物的抗病毒效果，從中發(fā)現(xiàn)了一些效果不錯(cuò)的候選藥物，如丙戊酸、芫花素、楊梅黃酮、甘油月桂酸酯等[26-29]。有研究發(fā)現(xiàn)，ASFV拮抗干擾素產(chǎn)生的基因與病毒的致病力密切相關(guān)，因此缺失該基因是研發(fā)ASFV疫苗的重要策略之一[30]。

在非洲豬瘟的免疫逃逸方面，研究發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒編碼的pI215L蛋白能夠抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，通過(guò)招募與該蛋白相互作用的E3泛素連接酶RNF138，并促進(jìn)RNF138降解RNF128，進(jìn)而抑制RNF128對(duì)TBK1的K63位泛素化修飾，最終抑制IFN-β的產(chǎn)生[31]。病毒免疫抑制蛋白ASFV MGF505-11R可以負(fù)調(diào)控cGAS-STING介導(dǎo)的信號(hào)通路，進(jìn)而抑制I型干擾素的產(chǎn)生，其中C端（1-360aa）結(jié)構(gòu)域是主要的免疫抑制功能區(qū)[32]。在減毒毒株方面，Chen等[33]使用我國(guó)第一株非洲豬瘟病毒分離株為材料，使用同源重組構(gòu)建缺失型病毒，篩選出一株缺失7個(gè)基因的病毒（HLJ/18-7GD），可以對(duì)非洲豬瘟病毒強(qiáng)毒的致死性攻擊提供有效的免疫保護(hù)。非洲豬瘟病毒缺失左可變區(qū)域的毒株（ASFV-G-ΔI177L）仍然能夠在穩(wěn)定細(xì)胞系中增殖，并且保持著初代時(shí)的免疫原性，使其可能成為商業(yè)化推廣的減毒疫苗[34,35]。ASFV-G-ΔA137R缺失株缺失A137R基因后，接種低劑量仍能夠保持豬只健康，病毒未發(fā)生增殖，并且針對(duì)原始毒力的毒株感染時(shí)引起較強(qiáng)的特異性抗體保護(hù)反應(yīng)。這些減毒株疫苗的研發(fā)，將為大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)疫苗提供重要的理論基礎(chǔ)。

5 展望

自2018年非洲豬瘟疫情在我國(guó)遼寧首次報(bào)道后，我國(guó)已撲殺生豬超過(guò)300萬(wàn)頭，對(duì)我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)及肉類市場(chǎng)供給造成了嚴(yán)重影響。盡管，目前通過(guò)一系列防控措施后，非洲豬瘟的影響減小了，但是仍要做好長(zhǎng)期防控非洲豬瘟的準(zhǔn)備。尤其是，近期發(fā)現(xiàn)基因I型非洲豬瘟病毒入侵我國(guó)，使得我國(guó)防控非洲豬瘟形勢(shì)更加嚴(yán)峻。盡管非洲豬瘟病毒I型對(duì)豬的致死率較低，但其傳播能力強(qiáng)，并可以引起豬只的一些慢性感染。由于病毒感染進(jìn)程緩慢，臨床表現(xiàn)多樣化，也將為非洲豬瘟的早期診斷帶來(lái)新挑戰(zhàn)。

因此，針對(duì)復(fù)雜嚴(yán)峻的非洲豬瘟防控形勢(shì)，我國(guó)應(yīng)采取更加有效的措施進(jìn)行預(yù)防和管控。主要建議如下：一是加大科研研發(fā)投入，重點(diǎn)攻克非洲豬瘟疫苗研發(fā)、非洲豬瘟感染致病機(jī)制等關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題；二是建立非洲豬瘟防控監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)全國(guó)非洲豬瘟發(fā)生點(diǎn)進(jìn)行信息互通，及時(shí)處置，精準(zhǔn)撲殺消毒；三是加強(qiáng)監(jiān)管生豬運(yùn)輸，區(qū)域阻斷，嚴(yán)厲打擊感染非洲豬瘟豬只的轉(zhuǎn)運(yùn)及流入市場(chǎng)；四是加強(qiáng)感染非洲豬瘟豬只的無(wú)害化處理監(jiān)管，指導(dǎo)大型企業(yè)建立病死豬無(wú)害化處理裝置，建立公共無(wú)害化處理點(diǎn)；五是規(guī)范飼養(yǎng)管理流程，精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)和治療，提高豬只免疫力和抗病能力；六是加強(qiáng)抗病育種研發(fā)，科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)聯(lián)合培育出抗病能力強(qiáng)的種豬，打造我國(guó)種豬“芯片”。

6 小結(jié)

綜上所述，防控非洲豬瘟是保障我國(guó)生豬行業(yè)健康發(fā)展的重要基點(diǎn)，只有政府、科研機(jī)構(gòu)、企業(yè)、個(gè)人多方面協(xié)同配合努力，才能將非洲豬瘟控制在合理范圍，確保我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。