犬冠狀病毒的檢測與防治措施

張婷 蔣郁明 曾俊霞 侯月娥* 費奕強 薛曉陽

（1，珠?？扑嚻諜z測科技有限公司 519000；2，廣東省珠海市動物疫病預(yù)防控制中心 519000；3，天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 300000）

新冠疫情在全球爆發(fā)以來，對人類健康及公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重的威脅。同時，也引起了人們對冠狀病毒的高度重視。冠狀病毒是一類大型的病毒家族。自然宿主范圍很廣可感染多種脊椎動物，如人類、犬、貓及家禽等，引發(fā)人類或動物嚴(yán)重的消化道、呼吸道及神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。犬冠狀病毒是冠狀病毒的一種，最早是由Binn 等在1971 年從腹瀉的德國軍犬中分離到，從此在全世界流行爆發(fā)[2]。犬冠狀病毒主要引起犬急性腸胃炎。臨床表現(xiàn)為頻發(fā)嘔吐、腹瀉最終出現(xiàn)嚴(yán)重的脫水或酸中毒，導(dǎo)致犬只死亡[3]。對犬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅[4]。本文主要從犬冠狀病毒的病原特征、流行特點、發(fā)病機制、臨床癥狀、診斷方法及防治措施等對犬冠狀病毒進行綜述。以期為犬冠狀病毒引發(fā)的各種疾病的綜合防治提供理論參考。

1 病原

冠狀病毒屬于套式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬?？梢鸲喾N動物的急慢性疾病。2011 年，國際病毒分類委員會將冠狀病毒分為α、β、γ 和δ 4 個屬[5]。犬冠狀病毒、貓冠狀病毒與豬傳染性腸胃炎病毒同屬于α 屬冠狀病毒。犬冠狀病毒是一類具有囊膜結(jié)構(gòu)的單鏈RNA 病毒[6]。該病毒成圓球形或橢圓形，直徑約為60～200nm，表面具有冠狀病毒特有的放射形突起，均勻分布于整個病毒的表面。犬冠狀病毒對熱、紫外線、脂溶劑、非離子去污劑、甲醛和氧化劑等一般的化學(xué)藥品均敏感，對酸穩(wěn)定[7]。在-70℃狀態(tài)下可保存數(shù)年；4℃可保存數(shù)月仍具有感染性[8]。

2 流行病學(xué)

犬冠狀病最早是1971 年Binn 等在德國患病軍犬中首次成功分離。后來被用于廣泛的研究。我國初次發(fā)現(xiàn)犬冠狀病毒是在1985 年，由徐漢坤等首次報道有犬冠狀病毒的流行[9]，后來犬冠狀病毒感染警犬、軍犬、民用犬的事件被相繼報道。犬冠狀病毒的感染沒有物種特異性，不同品種、年齡的犬只均可被感染。同時，對犬科的狐貍及貉也具有感染性。但相對成年犬來說，幼犬更容易被感染。2016 年孫秋艷在山東地區(qū)進行寵物犬冠狀病毒病的流行病學(xué)調(diào)查中表明，一歲以內(nèi)的幼犬檢出率為25.2%～72.4%；2 月齡～4 月齡犬的檢出率為72.4%；大于1歲犬冠狀病毒的檢出率低于13.4%[10]。犬冠狀病毒感染具有明顯的季節(jié)性。全國范圍的調(diào)查顯示，在春季、秋末及冬季溫度較低的季節(jié)犬只發(fā)病率更高。而在夏季由于犬冠狀病毒引起的疾病發(fā)生較少[11]。犬冠狀病毒主要以病犬和帶毒犬的糞便和污染水源為主要傳染源?？梢酝ㄟ^攝食、飲水間接或直接傳染給易感犬只。感染率為100%，病死率為50%。所以要對患病犬及時進行隔離處理，并對犬舍進行全面的消毒處理。對病死犬要進行深埋處理，禁止解剖及食用。

3 發(fā)病機制

犬冠狀病毒主要以病犬和帶毒犬的糞便和污染水源為主要傳染源。經(jīng)糞口途徑進入易感犬的體內(nèi)，在感染后2d 到達十二指腸部分[12]。病毒表面的S 蛋白與宿主小腸內(nèi)的細胞受體進行特異性結(jié)合，然后經(jīng)過細胞膜的胞吞作用進入小腸絨毛間的吸收細胞內(nèi)[13-14]。之后病毒利用宿主本身的復(fù)制系統(tǒng)幫助其自身進行復(fù)制增殖，在胞質(zhì)空泡的平滑膜上出芽，造成細胞破裂[15]。犬冠狀病毒被重新釋放出來，加劇小腸部分的感染。最終造成小腸絨毛變粗變短，消化酶分泌停止，消化吸收能力大大降低。造成犬只腹瀉[16]。如不及時對患病犬消炎補液，最終會導(dǎo)致機體嚴(yán)重脫水或酸中毒而死。一般情況下，只有犬冠狀病毒感染致死力較弱。但犬冠狀病毒會嚴(yán)重損害犬體內(nèi)的NK細胞和調(diào)節(jié)性T 細胞，大大降低宿主的免疫力[17]。當(dāng)與輪狀病毒、犬細小病毒混合感染或遭遇氣溫驟變、運輸、應(yīng)激情況時易對犬只造成致命性的威脅。

4 臨床癥狀

感染犬冠狀病毒的犬只臨床癥狀主要表現(xiàn)為精神不振、喜臥、嘔吐、腹瀉、血便，并伴隨強烈的腹痛。多數(shù)犬只體溫變化不大，感染前期嘔吐物主要為未消化的食物，后期嘔吐物為黃色泡沫樣及黏稠的液體。隨后出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉癥狀。糞便呈糊狀或半糊狀甚至水樣，呈橙色或綠色，其中含有黏液或血液[18]。最終犬只出現(xiàn)脫水或酸中毒現(xiàn)象。臨床上幼犬的發(fā)病現(xiàn)象比成年犬嚴(yán)重。病程為7～10d，部分幼犬在發(fā)病1～2d 后死亡，成年犬在服用藥物一周內(nèi)便可恢復(fù)，但在一個月內(nèi)可能會有復(fù)發(fā)[19]。

5 診斷方法

犬冠狀病毒引起的感染與輪狀病毒感染出現(xiàn)的臨床癥狀相似，并且常與輪狀病毒、犬細小病毒混合感染，所以準(zhǔn)確的鑒定犬冠狀病毒需要做進一步的實驗室檢測。目前實驗室檢測犬冠狀病毒的方法主要有病毒分離培養(yǎng)、電鏡觀察及血清學(xué)診斷技術(shù)、普通RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR、納米PCR 等。

5.1 病毒分離培養(yǎng)

對患病犬的糞便進行取樣，在無菌條件下進行離心，取上清液于0.22um 的過濾器中進行過濾。然后將犬冠狀病毒接種于犬腎臟細胞的細胞培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2條件下在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2d[20]。接種了犬冠狀病毒的細胞表現(xiàn)出細胞變圓、脫落沒有明顯的細胞輪廓的病變癥狀。該實驗方法具有直觀、簡便等優(yōu)點。但該實驗方法與高通量篩選的方法相比靈敏度較差，耗費時間較長，人為因素較多，容易造成較大的結(jié)果誤差。

5.2 電鏡觀察

由于犬冠狀病毒具有獨特的外形特征，所以可以使用電鏡對其進行鑒定，觀察病毒周圍“冠”的有無[21]。但該實驗方法的實驗誤差較大，使用費用昂貴等一系列缺點限制其使用，且容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因為冠狀病毒易變異，變異毒株會出現(xiàn)冠脫落或冠不明顯等一系列特點。

5.3 血清學(xué)診斷技術(shù)

臨床診斷上檢測疾病較為常用的方法是血清學(xué)診斷。血清學(xué)診斷主要包括中和實驗及間接ELISA 方法。熊煒等[22]通過構(gòu)建重組質(zhì)粒對犬冠狀病毒蛋白編碼基因進行克隆、表達，之后對蛋白進行純化，建立了犬冠狀病毒間接ELISA 的方法。中和實驗是由Binn 等[23]首先創(chuàng)立的，對患病犬的血清進行采集然后進行實驗鑒定。該實驗方法具有極高的特異性，甚至優(yōu)于ELISA 法。

5.4 普通RT-PCR

與以上實驗方法相比，普通RT-PCR 具有特異性強、靈敏度高等一系列優(yōu)點。普通RT-PCR 可以對輕微患病犬進行病原檢測[24]。但該實驗方法不能定量檢測犬冠狀病毒的載量。且在其實驗過程中易出現(xiàn)假陽性及非特異性擴增等問題。

5.5 實時熒光定量RT-PCR

實時熒光定量RT-PCR 作為近年來發(fā)展起來的一種可用于病原體檢測的技術(shù)，具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，能在較短時間內(nèi)完成病原體檢測，被廣泛應(yīng)用于動物疾病檢測、臨床診斷等領(lǐng)域[25]。在犬冠狀病毒特異性檢測中，熒光定量RT-PCR 比普通RT-PCR 的靈敏度高10 倍。且同時具有準(zhǔn)確率高、檢測速度較快、重復(fù)性好等一系列的優(yōu)點。但該實驗操作需要精密的儀器及熟練的操作人員，不適用于臨床上的廣泛研究。

5.6 納米PCR

納米PCR 主要是在普通PCR 基礎(chǔ)上，在PCR 反應(yīng)體系中加入納米金顆粒。納米金顆粒具有較高的表面活性，可以與酶分子進行特異性結(jié)合并保持穩(wěn)定。同時，由于納米金顆粒具有較小的尺寸，可以調(diào)節(jié)聚合酶與DNA 之間的特異性結(jié)合，間接的調(diào)整聚合酶濃度，有助于引物與模板結(jié)合，提高目的基因片段的擴增效率。與此同時，納米金顆粒良好的熱傳導(dǎo)性能有助于縮短變性時間，提高反應(yīng)靈敏度[26]。在退火時，抑制非特異性片段的合成，提高PCR 的保真度。由于納米PCR 操作簡單，成本上低于熒光定量PCR，因此，納米PCR 更適用于臨床疾病的快速診斷。

6 防治措施

現(xiàn)在犬冠狀病毒的治療沒有特效藥，多采取“預(yù)防為主，加強管理的原則”。預(yù)防措施主要為每天打掃犬舍，保持犬舍清潔。對帶毒母犬的產(chǎn)房及乳房要進行嚴(yán)格的消毒處理。同時，給健康犬只注射犬免疫球蛋白和犬冠狀病毒高免血清，增強犬的免疫力。由于犬冠狀病毒具有垂直傳播的特點，所以可以對妊娠母犬注射疫苗，激發(fā)母犬體內(nèi)的機體免疫，幼犬通過乳汁獲得抗體，增強幼犬免疫力。

如發(fā)現(xiàn)患病犬，首先應(yīng)對患病犬只進行及時的隔離處理。并對病犬的排泄物、犬舍及接觸物進行消毒，切斷病原傳播途徑。針對患病犬只主要采取糾正機體脫水、防止酸中毒、抑制嘔吐、抗病毒為主的治療原則。因該病主要引起犬只嚴(yán)重腹瀉，造成犬只脫水，所以應(yīng)對患病犬及時補充葡萄糖、電解質(zhì)、鉀離子及三磷酸腺苷糾正犬體內(nèi)的酸堿及電解質(zhì)失衡。同時，為了避免病犬混合感染犬細小病毒、輪狀病毒可以采取干擾素、球蛋白相配合的治療方法。犬在患病后，胃腸功能減弱或紊亂，盲目飼喂只能增加腸胃負擔(dān)，導(dǎo)致病情進一步加重。所以，在病犬不再嘔吐后可以投喂一些容易消化的食物[27]。嚴(yán)禁解剖和食用病死犬，應(yīng)進行深埋處理。然后用生石灰、1:30漂白粉溶液、0.2%～1%甲醛溶液等有效消毒劑徹底消毒飼養(yǎng)場地和圈舍，避免健康犬接觸病死犬污染物。

7 展望

犬冠狀病毒在我國家犬、軍犬及流浪犬之間普遍存在。該類病毒在復(fù)制過程中極易發(fā)生突變，治病能力也在逐漸增強。犬冠狀病毒主要引起犬只嘔吐、腹瀉導(dǎo)致犬只脫水或酸中毒。但目前對該病毒的認識及重視程度遠遠不夠。在2019 年由SARS-COV-2 引起的新冠疫情對世界各國人們的生命健康及經(jīng)濟發(fā)展造成了巨大的影響，也引起了人們對冠狀病毒的高度重視?；蚪M同源性結(jié)果分析顯示，SARS-COV-2 于犬冠狀病毒的同源52.6%～53.0% 。雖然犬冠狀病毒與SARS-COV-2較低，但也應(yīng)引起人們的重視，以探索冠狀病毒的起源及對不同宿主的致病性。未來還應(yīng)進一步完善全國各地的犬冠狀病毒流行范圍，為研發(fā)更加高效的診斷技術(shù)及疫苗提供參考依據(jù)。