五味子藤莖多糖小鼠經(jīng)口最大耐受量的測(cè)定

李 賀，陳紅旭，牛勝男，陳建光

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱“北五味子”，又稱“玄及”“會(huì)及”“山花椒”“五梅子”等[1].《新修本草》記載其“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味”，故名五味子[2].在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論中，可用于久嗽虛喘、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴和心悸失眠等病癥[1]，還具滋補(bǔ)強(qiáng)身之力，有很高的藥用和食用價(jià)值[3].

目前，五味子的食藥部位主要為果實(shí)，其研究也集中于五味子果的炮制加工[2]、活性成分提取及藥理功效[3]等.為實(shí)現(xiàn)果實(shí)的高產(chǎn)率和高品質(zhì)，藤莖作為非藥用部位常被減掉，除少部分作為調(diào)料粉被使用外，絕大多數(shù)則被直接丟棄[4].然而，現(xiàn)代藥物分析研究[5]發(fā)現(xiàn)，五味子藤莖多糖具有和果實(shí)相似的有效成分，有研究[6]表明，藤莖多糖具有與果實(shí)多糖相似的作用，如藤莖多糖可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠產(chǎn)生抗疲勞作用，抑制ACC、FAS等蛋白表達(dá)對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠發(fā)揮治療作用[5].因此，五味子藤莖作為五味子果實(shí)的補(bǔ)充資源應(yīng)該深入開(kāi)發(fā)[7]，在確定其藥用價(jià)值的同時(shí)，對(duì)其進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)尤為重要.目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)藤莖多糖的安全性報(bào)道.

本研究通過(guò)測(cè)定小鼠MTD，可為后續(xù)進(jìn)行藤莖多糖的研究提供毒理學(xué)基礎(chǔ).五味子藤莖若能作為五味子的補(bǔ)充資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)，實(shí)現(xiàn)全株的高效利用，將有利于五味子的可持續(xù)發(fā)展及非藥用部位的綜合開(kāi)發(fā)利用.

1 材料與儀器

1.1 動(dòng) 物

ICR小鼠(長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(吉)-2020-0001)20只，體質(zhì)量19～21 g，飼養(yǎng)溫度21～24 ℃，濕度40%～60%，12 h晝夜循環(huán)，給予鼠糧5 g/只，自由飲水，適應(yīng)環(huán)境7 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn).本實(shí)驗(yàn)通過(guò)北華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn).

1.2 材 料

五味子藤莖多糖(吉林省五味子開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化工程研究中心)，碳水化合物含量為28.1%；多糖提取率為6%.

1.3 儀 器

ZZ-6小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀、YLS-13A型大小鼠抓力測(cè)定儀、BA-200小鼠避暗儀(成都泰盟科技有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

按照隨機(jī)平均分組的原則將ICR小鼠分為空白組(CON，蒸餾水灌胃)、藤莖多糖組(SCP，24 g/kg五味子藤莖多糖水溶液灌胃)，藤莖多糖的最大水溶量即為灌胃劑量，灌胃容積0.4 mL/10 g，灌胃2次/d，并記錄體質(zhì)量，連續(xù)7 d.

2.2 小鼠一般狀態(tài)觀察

觀察實(shí)驗(yàn)期間小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、皮膚及眼的一般狀態(tài).

2.3 小鼠行為學(xué)變化觀察

實(shí)驗(yàn)第7天，于給藥后40 min后進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)、自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、抓力實(shí)驗(yàn)，觀察藤莖多糖對(duì)小鼠行為學(xué)的影響.

1)避暗實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6天，將小鼠放入避暗試驗(yàn)箱，打開(kāi)明暗箱通道，自主活動(dòng)5 min適應(yīng)環(huán)境.實(shí)驗(yàn)第7天，正式進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)，記錄5 min內(nèi)避暗潛伏期及避暗錯(cuò)誤次數(shù)[8].

2)自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)：將小鼠置于自主活動(dòng)測(cè)試儀中，觀察并記錄5 min內(nèi)活動(dòng)和站立的次數(shù).

3)抓力實(shí)驗(yàn)：根據(jù)小鼠喜用爪抓物的習(xí)性進(jìn)行前肢抓力測(cè)試，小鼠抓握金屬桿，將前爪穩(wěn)定地從金屬桿拖出，小鼠可接受的最大張力即為前肢抓力.

2.4 臟器變化及臟器指數(shù)

實(shí)驗(yàn)第8天，應(yīng)用戊巴比妥鈉給小鼠麻醉后眼球取血，并取出小鼠臟器，肉眼觀察臟器變化，對(duì)心、肝、脾、肺、腎、腦進(jìn)行稱重，計(jì)算臟器指數(shù)(mg/g)：臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質(zhì)量(mg)/動(dòng)物體質(zhì)量(g).

2.5 小鼠組織病理學(xué)觀察

將小鼠心、肝、脾、肺、腎和腦組織浸入10%甲醛固定液中固定用于制作石蠟切片；HE染色后進(jìn)行400×的圖像采集.

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 體質(zhì)量曲線

由圖1可知，SCP組與CON組小鼠體質(zhì)量生長(zhǎng)曲線均呈自然穩(wěn)定的上升趨勢(shì)，且兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).

圖1 小鼠體質(zhì)量曲線

3.2 小鼠存活情況

本研究結(jié)果顯示：7 d內(nèi)小鼠全部存活，無(wú)一例死亡，也無(wú)中毒癥狀發(fā)生.見(jiàn)表1.

表1 小鼠中毒及死亡情況Tab.1 Poisoning and death of mice (n=10)

3.3 小鼠一般狀態(tài)

本研究結(jié)果顯示：SCP組與CON組比較，給藥7 d ICR 小鼠內(nèi)未出現(xiàn)臥伏、對(duì)外應(yīng)激反應(yīng)減少的現(xiàn)象，大小便正常，同時(shí)也未見(jiàn)其他異常反應(yīng).見(jiàn)表2.

表2 小鼠一般狀態(tài)Tab.2 General status of mice

3.4 小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

3.4.1 自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)

自主活動(dòng)是正常動(dòng)物的生理特征，可反映中樞興奮或抑制狀態(tài).大腦皮層興奮性與小鼠活動(dòng)、站立次數(shù)成正相關(guān)關(guān)系[9].由圖2可知，SCP組與CON組比較，小鼠活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).

圖2SCP對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響Fig.2Effect of SCP on autonomous activity in

3.4.2 避暗實(shí)驗(yàn)

避暗實(shí)驗(yàn)是利用小鼠具有趨暗避明習(xí)性設(shè)計(jì)的，分為明室和暗室，在暗室中給予電擊，小鼠將被迫逃回明室[10].觀察5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)(避暗次數(shù))及首次進(jìn)入暗室的時(shí)間(避暗潛伏期)，考察小鼠的學(xué)習(xí)記憶力，判斷小鼠行為狀態(tài).本研究結(jié)果顯示：與CON組比較，SCP組小鼠的避暗潛伏期和避暗次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見(jiàn)圖3.

圖3SCP對(duì)小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響Fig.3Effect of SCP on mouse avoidance

3.4.3 抓力實(shí)驗(yàn)

抓力測(cè)試可評(píng)價(jià)藥物對(duì)小鼠肢體力量及對(duì)肌肉力量的影響，同時(shí)也可作為小鼠衰老、神經(jīng)及肌肉損傷的判定標(biāo)準(zhǔn)[11].測(cè)定小鼠前肢抓力值結(jié)果顯示：與CON組比較，SCP組小鼠的抓力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見(jiàn)圖4.

圖4SCP對(duì)小鼠抓力的影響Fig.4Effect of SCP on mouse

3.5 臟器指數(shù)及病理學(xué)觀察

本研究結(jié)果顯示：SCP組與CON組小鼠的臟器指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3).SCP組與CON組小鼠各組織器官顏色及形態(tài)正常，肉眼觀察均無(wú)病變、出血點(diǎn)與壞死.各臟器組織切片HE染色結(jié)果見(jiàn)圖5.SCP組與CON組小鼠心肌形態(tài)正常，無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；肝臟細(xì)胞排列緊密，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索清晰，間質(zhì)無(wú)增生水腫；脾臟狀態(tài)良好，未見(jiàn)出血、水腫、壞死等病理變化；肺結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)無(wú)增生，無(wú)水腫、充血狀況，形態(tài)良好；腎臟組織腎小球結(jié)構(gòu)及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，管壁清晰，未見(jiàn)明顯增生；腦組織海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，并未發(fā)現(xiàn)排列紊亂及壞死情況.

表4 臟器指數(shù)Tab.4 Organ index

圖5組織病理學(xué)觀察Fig.5Histopathological observation

4 討 論

本研究通過(guò)五味子藤莖多糖的最大溶解量及最大灌胃量觀察實(shí)驗(yàn)小鼠MTD.在灌胃7 d內(nèi)，未見(jiàn)SCP組小鼠死亡，小鼠體質(zhì)量曲線呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)，全身狀態(tài)無(wú)明顯變化，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸及心血管系統(tǒng)、腸胃系統(tǒng)、眼及毛發(fā)等未出現(xiàn)異常，心、肝、脾、肺及腎等臟器指數(shù)也無(wú)明顯區(qū)別.

為初步探究SCP對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)、學(xué)習(xí)記憶能力以及運(yùn)動(dòng)耐力等方面的影響，我們進(jìn)行了自主活動(dòng)、避暗以及抓力實(shí)驗(yàn).在自主活動(dòng)中，與CON組相比，SCP組小鼠活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在避暗實(shí)驗(yàn)中，SCP組與CON組小鼠的避暗潛伏期和避暗次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在抓力實(shí)驗(yàn)中，未見(jiàn)SCP對(duì)小鼠前肢握力產(chǎn)生影響.可見(jiàn)，SCP對(duì)小鼠的基本活動(dòng)、基本學(xué)習(xí)記憶行為以及運(yùn)動(dòng)耐力無(wú)顯著影響.除上述指標(biāo)外，本研究還通過(guò)觀察組織形態(tài)學(xué)及臟器重量來(lái)判斷藥物影響[12].臟器指數(shù)可在一定程度上反映藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒性及藥物產(chǎn)生毒性的靶器官的影響[13]，例如，肺臟指數(shù)不但可以反映機(jī)體肺部炎癥情況，也可反映小鼠肺的損傷程度；脾臟指數(shù)則反映機(jī)體免疫功能；肝臟作為解毒器官，其質(zhì)量變化可能與外源化合物脅迫所導(dǎo)致的能量支出多少有關(guān)，可將肝臟指數(shù)作為一個(gè)指標(biāo)觀察SCP對(duì)小鼠肝臟功能的影響.在本實(shí)驗(yàn)中，SCP組與CON組小鼠臟器指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).臟器病理學(xué)組織切片能更直觀地觀察各臟器的病理變化，在一定程度上能夠反映動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育及損傷情況[14-15].兩組小鼠病理切片顯示心、肝、脾、肺、腎及腦組織均無(wú)壞死及水腫等病變，肉眼觀察SCP組小鼠器官形態(tài)與CON組基本一致，說(shuō)明SCP對(duì)小鼠主要臟器未見(jiàn)損傷.

綜上所述，在SCP的小鼠經(jīng)口MTD為24 g/kg，是五味子臨床推薦使用量的184倍，SCP在該劑量下對(duì)小鼠的生長(zhǎng)、生理狀態(tài)及行為無(wú)影響.