茖蔥愈傷組織誘導(dǎo)與再分化培養(yǎng)基篩選

程廣有，唐曉杰，林 蔚

(北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013)

茖蔥(AlliumvictorialisL.)為百合科蔥屬草本植物，廣泛分布于北溫帶[1-2].茖蔥藥食同源，幼芽、莖葉、花蕾都可以食用.茖蔥莖葉中富含F(xiàn)e、Mn、Sr、Ba、Zn、B等微量元素，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[3-6].茖蔥具有止血、消炎、消腫、去痛功效，能夠提高人體免疫機(jī)能，治療感冒、咳嗽和上呼吸道疾病，降低膽固醇、降血脂和預(yù)防癌癥，被譽(yù)為 “菜中靈芝”[3，7-12].

茖蔥種子深度休眠，播種后隔年出苗[13-15].茖蔥實(shí)生苗5 a左右開始分蘗，分株繁殖在移栽后第3年植株開始分蘗，因此，分株繁殖十分困難[16].茖蔥種子休眠期長，播種不易出苗，分株繁殖系數(shù)低.同時(shí)，由于人工過度采挖，導(dǎo)致野生茖蔥數(shù)量越來越少，而人工栽培剛剛起步，市場供不應(yīng)求.利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)茖蔥快速繁殖，并且能夠克服實(shí)生繁殖導(dǎo)致的遺傳分化現(xiàn)象，完整保存原來植株的優(yōu)良性狀[17-18].目前，茖蔥組培繁殖的相關(guān)報(bào)道較少，繁殖系數(shù)低的問題尚未解決.本文從愈傷組織誘導(dǎo)、植株再生等方面進(jìn)行探討，為實(shí)現(xiàn)茖蔥工廠化快速繁殖提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 材 料

2019年6月，從茖蔥栽培基地挖取植株，剪掉葉片和根系，剝?nèi)ケ韺喻[片，取鱗莖中央的鱗片作為外植體.

1.2 方 法

1.2.1 外植體滅菌

先用自來水加洗潔精清洗茖蔥鱗片，在超凈工作臺內(nèi)，把清洗好的鱗片放入70%的乙醇水溶液中浸泡30 s，再轉(zhuǎn)移到0.1%氯化汞(HgCl2)溶液中浸泡，浸泡時(shí)間分別為5、7、9、12 min，浸泡期間攪拌3～5次，滅菌后用無菌水沖洗鱗片5次，切成0.5～1.0 cm小塊，備用.

1.2.2 培養(yǎng)基制備

1)基本培養(yǎng)基.在MS、White和WPM 3種基本培養(yǎng)基中均加入6-芐基-氨基-腺嘌呤(6-BA)1.0 mg/L和萘乙酸(NAA)0.3 mg/L.

2)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基.在MS培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的6-BA與2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)或NAA組合.

3)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基.在MS培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的6-BA和NAA.

4)壯苗培養(yǎng)基.MS培養(yǎng)基.

5)不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基.在1/2MS培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NAA和6-BA.

1.3 移栽基質(zhì)

松針土、旱田土和草甸土.

1.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度24～26 ℃，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，光照時(shí)間12～14 h/d.

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌時(shí)間

利用0.1%HgCl2對茖蔥鱗片進(jìn)行表面滅菌，滅菌后用無菌水沖洗5次，接種到初代培養(yǎng)基中.在25 ℃條件下培養(yǎng)15 d，觀察污染率與死亡率.結(jié)果顯示，氯化汞滅菌時(shí)間越長，污染率越低.滅菌12 min無污染，但由于滅菌時(shí)間過長會導(dǎo)致小塊茖蔥鱗片死亡，沒有愈傷組織形成；滅菌9 min基本無污染，外植體被殺死的數(shù)量較少(表1).由此表明，0.1%HgCl2水溶液浸泡9 min是茖蔥鱗片的適宜滅菌時(shí)間.

表1 滅菌時(shí)間與外植體污染率

2.2 基本培養(yǎng)基篩選

不同植物對營養(yǎng)成分的種類和數(shù)量需求不同.將茖蔥鱗片分別接種到MS、White和WPM基本培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)3周后調(diào)查愈傷組織發(fā)生情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在不同基本培養(yǎng)基中愈傷組織發(fā)生時(shí)間和生長狀況不同.茖蔥鱗片在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后大部分形成愈傷組織，且愈傷組織發(fā)生率最高(97.33%)；在WPM培養(yǎng)基中需要11 d形成愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為81.67%；在White培養(yǎng)基中形成愈傷組織的時(shí)間為12 d，誘導(dǎo)率為75.67%.茖蔥鱗片在MS培養(yǎng)基中形成的愈傷組織為乳白色、有光澤，生物量最大；在WPM和White培養(yǎng)基中形成的愈傷組織為淺褐色，顏色暗、生物量較小(表2、圖1)，說明MS培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)物質(zhì)最接近茖蔥生長需要，是最適宜茖蔥組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基.

表2 基本培養(yǎng)基與茖蔥愈傷組織Tab.2 Basic medium and callus of Allium victorialis

圖1基本培養(yǎng)基與愈傷組織Fig.1Basic medium and callus

2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

2.3.1 6-BA、2，4-D組合與茖蔥愈傷組織誘導(dǎo)效果

6-BA和2，4-D不同用量組合對茖蔥愈傷組織誘導(dǎo)的效果不同.隨著植物生長調(diào)節(jié)劑用量的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率提高，生物量也增大.當(dāng)6-BA用量為1.5 mg/L，2，4-D用量為0.2、0.3、0.4 mg/L時(shí)外植體啟動較快(時(shí)間分別為7、6和7 d)，愈傷組織誘導(dǎo)率(分別為97.34%、98.56%、96.45%)和生物量(分別為2.17、2.46、2.31 g/瓶)高于其他組合(表3)，MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L誘導(dǎo)茖蔥鱗片愈傷組織效果較好.

表3 6-BA和 2，4-D組合與愈傷組織誘導(dǎo)效果Tab.3 Effect of combination of 6-BA and 2，4-D on callus induction

2.3.2 6-BA、NAA組合與茖蔥愈傷組織誘導(dǎo)效果

外植體接種3 d后開始膨大，10 d后陸續(xù)在外植體切口處出現(xiàn)愈傷組織.茖蔥鱗片在6-BA 與NAA組合的MS培養(yǎng)基中愈傷組織形成時(shí)間晚于6-BA與2，4-D組合，鮮重也偏低.當(dāng)培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑用量增加時(shí)，茖蔥鱗片愈傷組織誘導(dǎo)率提高、生物量增大.在MS培養(yǎng)基中添加6-BA 1.5 mg/L，NAA為0.2、0.3和0.5 mg/L時(shí)愈傷組織發(fā)生早(時(shí)間分別為8、9、9 d)，誘導(dǎo)率(分別為98.75%、97.68%、94.54%)和生物量(分別為2.26、1.92、2.18 g/瓶)高于其他組合(表4)，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L誘導(dǎo)茖蔥鱗片愈傷組織效果較好.

表4 6-BA 和NAA組合與愈傷組織誘導(dǎo)效果Tab.4 Effect of combination of 6-BA and NAA on callus induction

2.4 不定芽增殖

在超凈工作臺上將愈傷組織切成小塊，轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3周時(shí)，愈傷組織開始出現(xiàn)小凸起，4周后愈傷組織陸續(xù)形成不定芽.不定芽分化率和數(shù)量隨著MS培養(yǎng)基中6-BA用量的增加表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，即當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA用量從0.5 mg/L提高到1.5 mg/L時(shí)，不定芽發(fā)生率和數(shù)量都呈上升趨勢；當(dāng)MS培養(yǎng)基中6-BA用量達(dá)到1.5 mg/L時(shí)，不定芽增殖效果最好；當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA用量為2.0 mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率和數(shù)量不再增加(圖2，表5).MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到97.66%，不定芽數(shù)量最多(平均5.16個(gè)).根據(jù)不定芽增殖效果，確定茖蔥繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，繼代周期為45 d.

圖2愈傷組織再分化Fig.2Redifferentiation of callus

表5 6-BA和NAA組合與不定芽誘導(dǎo)效果Tab.5 Effect of adventitious bud induction and combination of 6-BA and NAA

2.5 不定根誘導(dǎo)與移栽

將增殖培養(yǎng)中細(xì)弱的叢生不定芽切割下來轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基(不添加生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基)中培養(yǎng).壯苗培養(yǎng)21 d后，將健壯芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根.茖蔥不定芽在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d后陸續(xù)生根.在1/2MS培養(yǎng)基中加入少量NAA即可生根，隨著培養(yǎng)基中NAA添加量的增加，不定根誘導(dǎo)率和不定根數(shù)量都呈現(xiàn)先升后降的趨勢.茖蔥芽苗在1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L中不定根發(fā)生率最高(平均99.12%)、單株根數(shù)最多(平均5.12條)，培養(yǎng)30 d后根長1 cm以上(表6).不定根發(fā)生數(shù)量多的瓶苗葉片翠綠、生長較快(圖2).

表6 6-BA和NAA組合與不定根誘導(dǎo)效果Tab.6 Effect of adventitious root induction and combination of 6-BA and NAA

茖蔥組培苗根長至2.0 cm時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出，在含有1.2 g/L多菌靈的水溶液中洗去殘留培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)過高錳酸鉀滅菌的松針土、旱田土和草甸土中.第1周空氣相對濕度保持在90%以上，第2周空氣相對濕度保持在75%～80%，第3周空氣相對濕度保持在70%以上.溫度控制在20～25 ℃，前2周利用遮陰網(wǎng)降低光照強(qiáng)度，3周后轉(zhuǎn)為自然光照.煉苗期間保持通風(fēng)良好.組培苗移栽后每隔7 d噴1次1.2 g/L多菌靈水溶液.移栽3周后，組培苗長出新葉、發(fā)出新根，表明移栽成活，可以在自然條件下正常管理.

表7 不同基質(zhì)與移栽成活率

不同基質(zhì)與移栽成活率見表7.由表7可見：在3種移栽基質(zhì)中，以松針土為基質(zhì)時(shí)組培苗成活率最高(平均96.58%)，其次是草甸土(91.46%)，旱田土中組培苗成活率最低(86.87%).因此，建議在量化生產(chǎn)時(shí)選擇松針土為茖蔥組培苗移栽基質(zhì).

3 小結(jié)與討論

3.1 小 結(jié)

優(yōu)質(zhì)苗木數(shù)量不足是當(dāng)前茖蔥規(guī)?；耘嗟闹萍s因素.針對這一問題，本文研究了茖蔥愈傷組織誘導(dǎo)和再分化的培養(yǎng)基組成.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以茖蔥鱗片為外植體時(shí)，采用0.1%氯化汞水溶液浸泡9 min是適宜的表面滅菌時(shí)間；茖蔥鱗片在MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的愈傷組織較好，以MS為基本培養(yǎng)基有利于茖蔥組織培養(yǎng)；茖蔥鱗片在MS培養(yǎng)基中加入6-BA與2，4-D或NAA組合都可以誘導(dǎo)愈傷組織，其中，MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L和MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L誘導(dǎo)愈傷組織效果較好；6-BA與2，4-D或NAA組合誘導(dǎo)的愈傷組織都能夠分化出不定芽，而6-BA與NAA組合誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量較多，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到97.66%；茖蔥芽苗在1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L中不定根發(fā)生率最高(平均99.12%)、單株根數(shù)最多(平均5.12條)，以松針土為基質(zhì)時(shí)組培苗成活率最高(平均96.58%).

3.2 討 論

優(yōu)良的愈傷組織通常具有旺盛的自我增殖能力、高度的胚性或再分化能力，經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性[19].能否誘導(dǎo)出優(yōu)良的愈傷組織，不僅與培養(yǎng)基種類有關(guān)，而且與植物激素或植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類及配比密切相關(guān)[20].劉濟(jì)明等[21]研究表明，MS 培養(yǎng)基適合米槁葉片愈傷組織誘導(dǎo)，這與本次研究結(jié)果一致.在茖蔥愈傷組織誘導(dǎo)過程中，MS培養(yǎng)基好于White和WPM培養(yǎng)基，愈傷組織發(fā)生時(shí)間短、顏色淺、生長快.不同質(zhì)量濃度2，4-D和6-BA均對米槁葉片愈傷組織誘導(dǎo)有顯著影響，而NAA不同質(zhì)量濃度無顯著影響[21]，但本次研究表明，6-BA分別與2，4-D、NAA組合均可以獲得茖蔥愈傷組織，說明不同植物對生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的反應(yīng)不同.

外植體類型對愈傷組織的誘導(dǎo)效果起決定性作用，在以杉木葉片、莖段、子葉、下胚軸為外植體在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，形成愈傷組織的能力為葉片>莖段>子葉>下胚軸[22]；以油茶花藥為外植體可有效誘導(dǎo)愈傷組織形成[23]；以樟樹未成熟的合子胚和葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織效果較好[24].本次試驗(yàn)只選擇了茖蔥鱗莖為外植體，以其他材料誘導(dǎo)愈傷組織和再分化的情況也尚不清楚，還有待進(jìn)一步開展研究.