腸道黏蛋白MUC12與仔豬斷奶腹瀉的關(guān)系研究

孫 超，叢 赫，張思琦，謝雨萌，劉欣欣，李 柯

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

斷奶仔豬由于消化系統(tǒng)還沒有發(fā)育完善，消化酶、胃液分泌較少，免疫和體溫調(diào)節(jié)等生理功能不健全，斷奶后易產(chǎn)生三方面的應(yīng)激：即營(yíng)養(yǎng)、心理、環(huán)境［1］。其中營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激影響最大，容易發(fā)生仔豬斷奶應(yīng)激綜合征，主要有食欲障礙、消化不良、發(fā)育遲滯、飼料效率低下、反應(yīng)遲鈍、抗病能力弱、水腫和腹瀉等表現(xiàn)，其中腹瀉已成為斷奶仔豬最普遍且影響較大的應(yīng)激性疾病，造成體重下降、存活率降低［2］，直接影響豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。仔豬斷奶是其生長(zhǎng)發(fā)育過程中的一個(gè)必經(jīng)階段，而斷奶應(yīng)激性腹瀉一直是養(yǎng)豬生產(chǎn)的難題。

斷奶應(yīng)激能引起腸道形態(tài)、結(jié)構(gòu)的破壞和腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致杯狀細(xì)胞數(shù)量、機(jī)能受到影響，從而加重仔豬腹瀉。腸道作為動(dòng)物體內(nèi)最主要的消化吸收器官，對(duì)動(dòng)物體影響較大，腸道上皮細(xì)胞主要分為杯狀細(xì)胞（gobletcell，GC）、內(nèi)分泌細(xì)胞、吸收細(xì)胞和潘氏細(xì)胞4種，其中杯狀細(xì)胞能分泌黏蛋白和一些生物活性因子，與水結(jié)合形成黏液，可以抵御腸黏膜內(nèi)外源侵害，與上皮細(xì)胞緊密連接，與腸道微生物共同作用維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［3］。黏蛋白是杯狀細(xì)胞主要的分泌產(chǎn)物，其核心蛋白總稱為MUC，由黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄翻譯而來(lái)，在GC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)進(jìn)行聚合、修飾、糖基化和折疊，再分泌到細(xì)胞外，與腸腔內(nèi)一些物質(zhì)及水混合形成黏液凝膠［4］，這是宿主抵御腸道內(nèi)容物（如微生物和食物殘?jiān)┑牡谝坏婪谰€［5］。迄今共發(fā)現(xiàn)21種黏蛋白基因，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和定位分為分泌型和膜結(jié)合型兩類，杯狀細(xì)胞主要分泌形成黏液凝膠的分泌型黏蛋白，由5種寡聚體黏蛋白（MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC19）及1種非寡聚體黏蛋白（MUC7）組成，膜結(jié)合型蛋白主要包 括MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC12、MUC13、MUC16、MUC17、MUC20［3］。膜結(jié)合型蛋白主要依靠跨膜區(qū)與腸上皮細(xì)胞膜結(jié)合，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、黏附、生長(zhǎng)及相關(guān)免疫調(diào)節(jié)功能。民豬作為我國(guó)優(yōu)良的地方豬種之一，具有肉質(zhì)好和抗病力強(qiáng)等特性，具有極大的研究?jī)r(jià)值。民豬的腸道黏液屏障及其免疫功能是否優(yōu)于外來(lái)豬種、與仔豬斷奶后的腹瀉易感性有無(wú)關(guān)系，是值得深入研究的科學(xué)問題。本試驗(yàn)對(duì)仔豬各腸段杯狀細(xì)胞進(jìn)行著色度統(tǒng)計(jì)，采用qRT-PCR方法測(cè)定MUC12 mRNA相對(duì)表達(dá)量，以探究腸道黏蛋白MUC12與斷奶腹瀉的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)未進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以黑龍江省蘭西縣種豬場(chǎng)自繁的民豬仔豬和長(zhǎng)白豬仔豬為研究對(duì)象，隨機(jī)選取35日齡斷奶民豬48頭、長(zhǎng)白豬60頭，且所選仔豬均在斷奶前無(wú)腹瀉現(xiàn)象發(fā)生。民豬、長(zhǎng)白豬仔豬均選取2／3進(jìn)行斷奶處理。參照舒鄧群等［6］的腹瀉評(píng)分方法，根據(jù)跟蹤觀察仔豬斷奶后3 d內(nèi)腹瀉情況劃分為斷奶腹瀉組與斷奶健康組，斷奶健康組仔豬糞便外觀呈條形或粒狀；斷奶腹瀉組選擇中度腹瀉仔豬，糞便外觀為稠狀、不成形、糞水無(wú)分離。并在兩組仔豬38日齡分別隨機(jī)選取6頭仔豬屠宰（民豬、長(zhǎng)白豬各3頭）。民豬、長(zhǎng)白豬仔豬1／3為未斷奶組（對(duì)照組），也在38日齡屠宰（民豬、長(zhǎng)白豬各3頭）。共計(jì)屠宰18頭仔豬。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A），購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；TRIzol Reagent，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；熒光染料試劑盒（型號(hào)為46660900），購(gòu)自羅氏生物科技有限公司；PAS染液（型號(hào)為G1008）和石蠟，購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；DL 2 000 Plus DNA（型號(hào)為ZM405）Marker，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DEPC水（型號(hào)為R0021），購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

電泳儀（型號(hào)為DYY-Ⅲ-8B）、水平電泳槽（型號(hào)為DYY-Ⅲ33A），購(gòu)自北京市六一儀器廠；PCR儀（型號(hào)為TGRADIENT），購(gòu)自德國(guó)Biometra公司；微量移液器，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)為AB17500），購(gòu)自美國(guó)Applied-Biosystems公司；紫外分光光度計(jì)（型號(hào)為Ultrospec1000），購(gòu)自美國(guó)Phamacia公司；NikonDSRi1顯微鏡，購(gòu)自日本尼康公司。

2 方法

2.1 飼喂與斷奶

民豬和長(zhǎng)白母豬分娩后與所產(chǎn)仔豬在同一圈舍飼養(yǎng)，并用不同圈欄將母豬及同欄仔豬隔開。仔豬35日齡時(shí)，隨機(jī)將部分哺乳母豬趕走，仔豬仍留在原圈欄，開始飼喂教槽料進(jìn)行斷奶處理；而圈欄里未趕走的母豬繼續(xù)哺乳仔豬。待仔豬生長(zhǎng)至38日齡時(shí)處理全部仔豬。

2.2 樣品的采集

兩品種仔豬均在38日齡的上午09：00耳部靜脈注射藥物氯丙嗪鎮(zhèn)靜，并頸靜脈放血處死。采集仔豬十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸中段各組織樣約0.5 g，使用生理鹽水漂洗，除去血液和糞便，放入DEPC溶液處理過的EP管中，-80℃保存，備用；另取仔豬十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸中段各組織樣約1.5 g，在10%中性福爾馬林中保存，用于石蠟切片的制作。

2.3 腸道杯狀細(xì)胞著色度的統(tǒng)計(jì)

采集屠宰后仔豬十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸組織，由石蠟包埋后切片，經(jīng)高碘酸-Schiff氏劑（PAS）染色，通過NikonDS-Ri1顯微鏡（100×）觀察腸道杯狀細(xì)胞形態(tài)。參照參考文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行杯狀細(xì)胞著色度的統(tǒng)計(jì)，每頭仔豬各腸段取3張切片，每張切片隨機(jī)選擇6個(gè)不同視野，用Image J軟件進(jìn)行杯狀細(xì)胞著色度的數(shù)據(jù)采集。

2.4 RNA質(zhì)量判斷

采集斷奶健康組、斷奶腹瀉組、未斷奶組仔豬的腸道組織樣，提取各腸道組織總RNA，跑膠驗(yàn)證提取的總RNA質(zhì)量。

2.5 RT-PCR

使用β-actin基因引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳試驗(yàn)。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

仔豬腸道組織樣用于提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將其用作模板進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，采用相對(duì)定量法測(cè)定基因表達(dá)水平，所用的引物（見表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。擴(kuò)增體系（10μL反應(yīng)混合體系）：SYBR Green Master 5μL，上下游引物各0.4μL，ddH2O 3.2μL、cDNA模板1μL。反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，退火1 min，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理和計(jì)算；用SPSS 25軟件進(jìn)行方差分析；均數(shù)間用鄧肯氏法進(jìn)行多重比較，分析不同品種、不同組別仔豬腸道杯狀細(xì)胞著色度和MUC12 mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異；數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；用GraphPad Prism 8.0軟件繪制圖表。

3 結(jié)果與分析

3.1 腸道杯狀細(xì)胞的著色度統(tǒng)計(jì)

仔豬腸道杯狀細(xì)胞測(cè)定結(jié)果見圖1、圖2。由圖1可以看出，經(jīng)過PAS染色的腸道杯狀細(xì)胞在顯微鏡下輪廓清晰。

圖1 長(zhǎng)白豬和民豬腸道杯狀細(xì)胞Fig.1 Intestinal goblet cells of Landrace and Min pigs

由圖2可以看出：（1）長(zhǎng)白豬十二指腸杯狀細(xì)胞著色度斷奶健康組和斷奶腹瀉組顯著（P＜0.05）高于未斷奶組，而在空腸、回腸和結(jié)腸中長(zhǎng)白豬斷奶健康組著色度降低，且在空腸和回腸中均顯著（P＜0.05）、極顯著（P＜0.01）低于未斷奶組。民豬斷奶健康組在十二指腸、回腸和結(jié)腸中著色度也低于未斷奶組，其中在回腸中民豬斷奶健康組顯著（P＜0.05）低于未斷奶組。（2）品種間比較，民豬未斷奶組著色度在十二指腸、空腸均極顯著（P＜0.01）高于長(zhǎng)白豬，結(jié)腸中略高于長(zhǎng)白豬。民豬斷奶健康組十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中著色度均顯著（P＜0.05）、極顯著（P＜0.01）高于長(zhǎng)白豬。民豬斷奶腹瀉組在回腸中著色度顯著（P＜0.05）高于長(zhǎng)白豬，其余腸段均低于長(zhǎng)白豬。說明斷奶后民豬腸道仍含有更多的黏蛋白，以減輕斷奶應(yīng)激對(duì)腸黏膜的損傷，這可能是斷奶民豬腹瀉程度較低的原因之一。

圖2 腸道杯狀細(xì)胞著色度統(tǒng)計(jì)Fig.2 Colorimetric statistics of intestinal goblet cells

3.2 RNA質(zhì)量判斷

采集斷奶健康組、斷奶腹瀉組、未斷奶組仔豬的腸道組織樣，提取各腸道組織總RNA，跑膠驗(yàn)證提取的總RNA質(zhì)量。通過1%瓊脂糖凝膠做電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，樣品均呈現(xiàn)28 S、18 S、5 S 3個(gè)條帶，其OD260／OD280值為1.8～2.0。說明所用RNA的完整性和純度全部滿足反轉(zhuǎn)錄的要求。

圖3 RNA的電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The result of RNA electrophor

3.3 RT-PCR

使用β-actin基因引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物與所設(shè)計(jì)的目的片段長(zhǎng)度保持一致，證明反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 β-actin的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification products ofβ-actin gene

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

由于SYBR GreenⅠ熒光染料法定量PCR具有與雙鏈DNA非特異性結(jié)合的特殊性質(zhì)，為確認(rèn)檢測(cè)反應(yīng)的特異性，需要進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，β-actin、MUC12基因的熔解曲線具有重復(fù)性好、單一峰值的特點(diǎn)，說明引物具有特異性。

圖5 β-actin MUC12的擴(kuò)增熔解曲線Fig 5 Amplification and melting curves ofβ-actin MUC12

3.5 腸道MUC12mRNA相對(duì)表達(dá)量

民豬、長(zhǎng)白豬仔豬腸道MUC12mRNA相對(duì)表達(dá)量見圖6。由圖6可以看出：MUC12mRNA相對(duì)表達(dá)量在民豬、長(zhǎng)白豬十二指腸、空腸和回腸中很低，而在盲腸和結(jié)腸中明顯較高。十二指腸中，長(zhǎng)白豬和民豬斷奶健康組和斷奶腹瀉組MUC12 mRNA相對(duì)表達(dá)量沒有明顯差異；長(zhǎng)白豬各組MUC12 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于民豬，且長(zhǎng)白豬未斷奶組顯著高于民豬未斷奶組（P＜0.05）。但在空腸和回腸中，兩品種的各組間均無(wú)顯著差異。與未斷奶組比較，長(zhǎng)白豬斷奶健康組和斷奶腹瀉組盲腸MUC12 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，而民豬斷奶健康和斷奶腹瀉組極顯著（P＜0.01）升高，同時(shí)民豬斷奶健康組和斷奶腹瀉組盲腸MUC12 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著（P＜0.01）高于長(zhǎng)白豬斷奶健康組和斷奶腹瀉組；結(jié)腸中，與未斷奶組相比，長(zhǎng)白豬和民豬斷奶健康和斷奶腹瀉組MUC12 mRNA相對(duì)表達(dá)量均有所降低；品種間比較，民豬未斷奶組結(jié)腸中MUC12 mRNA表達(dá)量極顯著（P＜0.01）高于長(zhǎng)白豬。

圖6 腸道MUC12mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of intestinal MUC12mRNA

4 討論

腹瀉發(fā)生與腸道黏膜屏障完整性密切相關(guān)，黏蛋白是腸道黏液屏障的重要組成部分，在腸道黏膜保護(hù)和修復(fù)中發(fā)揮著不可缺少的作用，它們可以在腸道上皮表面形成保護(hù)層，保護(hù)腸道上皮完整并使其潤(rùn)滑，幫助細(xì)胞黏附，阻止病原體、毒素和異物的侵害［8］。分泌型黏蛋白是由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的，杯狀細(xì)胞與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，黏蛋白和杯狀細(xì)胞的發(fā)育在生命早期受到嚴(yán)格的調(diào)控，并與微生物定植同步，發(fā)育中的黏蛋白和杯狀細(xì)胞的失調(diào)與感染和炎癥條件有關(guān)［9］。在正常生理狀態(tài)下，黏液屏障內(nèi)黏蛋白含量相對(duì)穩(wěn)定，但如果消化道出現(xiàn)炎癥癥狀，會(huì)使黏蛋白的產(chǎn)生和分布受到一定程度的干擾。在炎癥的初期階段，杯狀細(xì)胞受到炎癥刺激，黏蛋白分泌急劇增多，這將導(dǎo)致杯狀細(xì)胞消耗大量能量，凋亡數(shù)量顯著增加，引起機(jī)體內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量下降，黏蛋白含量降低，腸道黏膜屏障受到損傷，致病菌和炎性因子更容易入侵機(jī)體，導(dǎo)致腸道抵抗力減弱，病情加重或繼發(fā)其他腸道疾?。?0］。有研究表明，患有炎癥性腸病（inflammatory boweldisease，IBD）的機(jī)體中杯狀細(xì)胞的分化及黏蛋白的表達(dá)、成熟及分泌均受影響［11-12］。在大多數(shù)腸道感染中，急性期發(fā)生杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)黏液蛋白的合成和分泌，杯狀細(xì)胞的快速大量分泌不僅有利于病原體的排出，還能維持黏液保護(hù)層的完整性［13］。本試驗(yàn)結(jié)果表明：腸道杯狀細(xì)胞著色度比較，民豬未斷奶組十二指腸、空腸、結(jié)腸均高于長(zhǎng)白豬，說明民豬在未斷奶時(shí)腸道就含有較高的黏蛋白含量，這可能對(duì)民豬腸道抵御斷奶應(yīng)激有一定的防御作用；在斷奶后，民豬斷奶健康組十二指腸、空腸、回腸杯狀細(xì)胞著色度都高于長(zhǎng)白豬，說明民豬在斷奶后黏蛋白含量仍高于長(zhǎng)白豬，能夠更好地保護(hù)腸道黏膜，減輕斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬腸道黏膜的損害，這可能是民豬斷奶后受到的應(yīng)激程度、腹瀉率低于長(zhǎng)白豬的重要生理基礎(chǔ)。

在黏液分泌細(xì)胞及其細(xì)胞系中，通過對(duì)早期小鼠模型的研究［14-15］，發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合型黏液蛋白和杯狀細(xì)胞分泌的分泌型黏液蛋白之間似乎存在表達(dá)協(xié)調(diào)和功能協(xié)調(diào)，這兩組分子都有助于上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)［16］。與分泌型黏蛋白不同，膜型黏蛋白是由機(jī)體中許多類型的非特化上皮細(xì)胞表達(dá)的，而MUC12作為跨膜型黏蛋白，特征是一個(gè)N端胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)黏蛋白結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端細(xì)胞質(zhì)尾，其磷酸化位點(diǎn)參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞［17］，在上皮細(xì)胞生長(zhǎng)方面發(fā)揮功能，進(jìn)一步促進(jìn)腸道的生長(zhǎng)發(fā)育、維護(hù)腸道的完整性；同時(shí)，MUC12在＞50%的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸、直腸腫瘤中高度表達(dá)，也在結(jié)腸和小腸的正常上皮細(xì)胞表達(dá)；潰瘍性結(jié)腸炎會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量減少、體積縮小，從而影響?zhàn)さ鞍追置诹繙p少，可見杯狀細(xì)胞和MUC12與腸道疾病密切相關(guān)［8，18］。腸道黏膜組織作為病原微生物侵染豬體的主要渠道，黏蛋白MUC12是腸道黏膜屏障中的重要成分，屏障損傷會(huì)導(dǎo)致豬出現(xiàn)腸道疾病，因此保持屏障的完整性對(duì)豬的腸道健康起著關(guān)鍵作用［19］。本試驗(yàn)中，MUC12 mRNA相對(duì)表達(dá)量在不同腸段組織有明顯差異，在十二指腸、空腸、回腸中幾乎不表達(dá)，在結(jié)腸和盲腸中表達(dá)量則比較高。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，形成腸黏液的黏蛋白在小腸和大腸中具有不同的性質(zhì)，小腸的孔隙很大，允許細(xì)菌和細(xì)菌化顆粒穿透黏液，小腸黏液的這種穿透性可能是致病菌主要通過其他方式感染腸道這一區(qū)域的主要原因，小腸黏液只有一層，通常很容易被吸入且不附著［19］；在結(jié)腸中有兩層黏液系統(tǒng)，其中外層黏液毛孔擴(kuò)張，使細(xì)菌得以滲透，而內(nèi)層黏液分層并組織成一個(gè)過濾器，內(nèi)層黏液的孔隙足夠小，可以阻止直徑小于0.5 mm的細(xì)菌或小珠的滲透［20］。黏蛋白在不同腸段性質(zhì)的差異可能是影響MUC12 mRNA相對(duì)表達(dá)量在不同腸段組織差異明顯的重要因素。結(jié)腸中，各組民豬MUC12mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于長(zhǎng)白豬，且未斷奶組MUC12mRNA相對(duì)表達(dá)量高于斷奶健康組和斷奶腹瀉組。分析原因可能與盲腸和結(jié)腸中存在的大量微生物和內(nèi)毒素，以及來(lái)自過敏性的食物源和外源因子有關(guān)，通過MUC12的較高表達(dá)可以與病原菌和內(nèi)毒素等物質(zhì)有效結(jié)合，降低外源因素對(duì)腸上皮的損傷和破壞，進(jìn)而增強(qiáng)腸道的保護(hù)功能。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，斷奶應(yīng)激會(huì)損傷豬腸道黏膜，導(dǎo)致腸道黏蛋白MUC12相對(duì)表達(dá)量降低，且民豬抗應(yīng)激腹瀉能力強(qiáng)于長(zhǎng)白豬。研究結(jié)果也暗示可通過增強(qiáng)MUC12的表達(dá)增加仔豬的抗腹瀉能力。