表面活性劑對(duì)鞣花酸的增溶及其抗氧化性能研究

伍佑輝，蔣新元，倪丹，賀靖雁，唐玉蓮，龐亞輝，段泉

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 理學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3.湖南省木本生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

鞣花酸是一種植物多酚，幾乎不溶于水及醇類(lèi)溶劑，而溶于吡啶、二甲基亞砜和三乙醇胺等[1-2]。既能抗炎、抗菌、抗病毒，又可以抗氧化、美白、抗衰老[3-4]，在化妝品中有很好的應(yīng)用前景。它已列入《國(guó)際化妝品原料標(biāo)準(zhǔn)目錄》(INCI)，也被列入國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《國(guó)際化妝品原料標(biāo)準(zhǔn)中文名稱(chēng)目錄》中[5]。研究[6]表明化妝品里所添加的鞣花酸含量極低，很難達(dá)到標(biāo)注所說(shuō)的美白功能及抗衰老能力。

本實(shí)驗(yàn)研究了非離子型表面活性劑對(duì)鞣花酸的增溶作用，及鞣花酸在表面活性劑增溶體系中對(duì)自由基的清除能力，為擴(kuò)大鞣花酸在化妝品[7]、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鞣花酸(w=98%)、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、DPPH、ABTS均為分析純；維生素C(簡(jiǎn)稱(chēng)Vc)。

TM-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；85-2A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器；BHS-1數(shù)顯恒溫水浴鍋；1510酶標(biāo)儀；96孔板。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鞣花酸在非離子表面活性劑溶液中的紫外光譜測(cè)定 在150 mL錐形瓶中分別加入30 mg的鞣花酸，再分別加入0.10 g/L的非離子表面活性劑Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80溶液各100 mL，置于磁力攪拌器上以500 r/min攪拌3 h，然后在35 ℃的恒溫水浴鍋中密封靜置24 h后定容搖勻，制備鞣花酸表面活性劑增溶體系。以相同濃度表面活性劑溶液作為參比，將制備鞣花酸表面活性劑增溶體系稀釋10倍后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其紫外吸收光譜。

1.2.2 表面活性劑溶液濃度對(duì)鞣花酸增溶的影響 選取增溶效果好的表面活性劑進(jìn)行濃度對(duì)鞣花酸增溶的影響研究。在150 mL錐形瓶中各加入30 mg 的鞣花酸，再加入一定體積配制好的表面活性劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制表面活性劑溶液濃度在0.001～50.00 g/L范圍的鞣花酸-表面活性劑增溶體系，然后置于磁力攪拌器上以500 r/min攪拌3 h，再在35 ℃ 的恒溫條件下密封靜置24 h后定容搖勻。以相應(yīng)濃度表面活性劑溶液作為參比，鞣花酸表面活性劑增溶體系稀釋10倍后在397 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)鞣花酸表面活性劑增溶體系標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算鞣花酸在表面活性劑溶液中的增溶濃度。

1.2.3 溫度對(duì)表面活性劑增溶鞣花酸的影響 選取濃度為10.00 g/L的表面活性劑溶液研究溫度對(duì)表面活性劑增溶鞣花酸的影響，其余操作方法同上，選擇溫度范圍5～45 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 鞣花酸表面活性劑增溶體系穩(wěn)定性的測(cè)定 在10.00 g/L的表面活性劑溶液中加入30 mg的鞣花酸，制備鞣花酸增溶體系，操作方法同上，在35 ℃ 恒溫條件下存放，測(cè)定增溶體系中鞣花酸吸光度隨時(shí)間的變化，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 鞣花酸表面活性劑增溶體系對(duì)ABTS·清除能力的測(cè)定 按照文獻(xiàn)[8]的方法，加以改進(jìn)。ABTS溶液按照文獻(xiàn)[9]配制：精密稱(chēng)取0.038 4 g的ABTS溶解于10 mL蒸餾水中，精密稱(chēng)取0.006 7 g的過(guò)硫酸鉀溶解于10 mL蒸餾水中，避光冷藏放置16～24 h，得到ABTS母液。實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水稀釋?zhuān)蛊湮舛?λ=734 nm)在(0.7±0.1) 。

鞣花酸增溶體系的配制：以10.00 g/L的Tween-20溶液配制鞣花酸濃度為50 mg/L的Tween-20增溶體系。然后用相同濃度的Tween-20溶液為稀釋液，配制鞣花酸濃度在0.10～8.00 mg/L范圍的系列鞣花酸Tween-20增溶體系。

對(duì)照品Vc溶液的配制：配制濃度在0.10～8.00 mg/L范圍的系列Vc溶液，配制好的溶液需避光保存。

ABTS·清除率的測(cè)定：在96孔板中按照文獻(xiàn)[10]取液，混合液在室溫避光反應(yīng)30 min后，用酶標(biāo)儀在734 nm下測(cè)吸光度值，計(jì)算抑制率。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔重復(fù)3次，取平均值。

ABTS·清除率(S,%)計(jì)算公式如下：

S=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

式中A0——空白組(ABTS溶液+溶劑)的吸光度值；A1——樣品組(ABTS溶液+樣品)的吸光度值；A2——對(duì)照組(水+樣品)的吸光值。

1.2.6 鞣花酸表面活性劑增溶體系對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定 按照文獻(xiàn)[8]的方法，加以改進(jìn)。DPPH溶液按照文獻(xiàn)[9]配制：稱(chēng)取5 mg DPPH(精準(zhǔn)至0.000 1 g)溶解于100 mL無(wú)水乙醇中，作為儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)蛊湮舛?λ=517 nm)在(0.7±0.1)。

鞣花酸增溶體系的配制：同1.2.5節(jié),稀釋配制鞣花酸濃度在0.20～10.00 mg/L范圍的系列鞣花酸Tween-20增溶體系。

對(duì)照品Vc溶液的配制：配制濃度在0.20～10.00 mg/L范圍的Vc溶液，配制好的溶液需避光保存。

DPPH·清除率的測(cè)定：在96孔板中按文獻(xiàn)[10]取液，混合液在室溫避光反應(yīng)30 min后，用酶標(biāo)儀在517 nm下測(cè)吸光度值，計(jì)算抑制率。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔重復(fù)3次，取平均值。

DPPH·清除率(S，%)計(jì)算公式如下：

S=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

式中A0——空白組(DPPH溶液+水)的吸光度值；A1——樣品組(DPPH溶液+樣品)的吸光度值；A2——對(duì)照組(無(wú)水乙醇+樣品)的吸光值。

1.2.7 粒徑分布及Zeta電位測(cè)定 在室溫下，將鞣花酸Tween-20增溶體系溶液注入測(cè)試項(xiàng)目對(duì)應(yīng)的比色容器中，在90°散射條件下對(duì)鞣花酸Tween-20增溶體系溶液的粒徑及電位進(jìn)行測(cè)試，重復(fù)3次取平均值。

1.2.8 透射電鏡(TEM)分析 用滴管取少量鞣花酸Tween-20增溶體系溶液滴加置200目銅網(wǎng)上，待滴加樣品的銅網(wǎng)自然風(fēng)干后，在50 ℃烘箱中干燥20 min除去多余的水分，然后置于TEM下尋找并分析鞣花酸Tween-20增溶體系溶液中的自聚體形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 非離子表面活性劑對(duì)鞣花酸的增溶效果

2.1.1 鞣花酸表面活性劑增溶體系中的紫外吸收光譜特征 非離子表面活性劑吐溫(Tween)系列溶液中鞣花酸的紫外吸收光譜見(jiàn)圖1。

圖1 Tween系列溶液中鞣花酸的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra of ellagic acid in Tween series solutions

由圖1可知，Tween系列溶液中鞣花酸在255 nm 處均有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，在397 nm處有一個(gè)弱吸收峰，與鞣花酸在水溶液中的紫外吸收光譜保持一致[1]，說(shuō)明鞣花酸在Tween系列溶液進(jìn)行增溶后結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生改變，鞣花酸在Tween系列溶液保持了鞣花酸原有的性質(zhì)和功效性。其中Tween-60的增溶效果明顯較低，而Tween-20、Tween-40、Tween-80溶液對(duì)鞣花酸的增溶效果相差不大，其中又以Tween-20的增溶效果最好。

2.1.2 鞣花酸在Tween-20溶液中標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 精確稱(chēng)取12.5 mg鞣花酸，用10.00 g/L的Tween-20溶液進(jìn)行溶解、攪拌、再使用超聲處理使其完全分散溶解后定容于250 mL容量瓶中，分別稀釋制備成鞣花酸濃度為1～25 mg/L系列鞣花酸Tween-20增溶體系，以相應(yīng)濃度的Tween-20溶液為參比，于397 nm處測(cè)定鞣花酸的吸光度，以增溶體系的吸光度(A)對(duì)鞣花酸濃度(C,mg/L)作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.045 65C-0.050 16(r=0.999 4)，見(jiàn)圖2，表明在1～25 mg/L內(nèi)，增溶體系中鞣花酸的吸光度與鞣花酸的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖2 鞣花酸Tween-20增溶體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ellagic acid Tween-20 solubilizing system

2.1.3 Tween-20溶液濃度對(duì)鞣花酸增溶效果的影響 不同濃度的Tween-20溶液對(duì)鞣花酸的增溶效果見(jiàn)圖3。

圖3 Tween-20溶液濃度對(duì)鞣花酸的增溶效果的影響Fig.3 Solubilization effect of Tween-20 solution concentrations on ellagic acid

由圖3可知，當(dāng)Tween-20溶液濃度較低時(shí)，鞣花酸的增溶隨著Tween-20溶液濃度的增加而顯著增加，當(dāng)Tween-20溶液濃度達(dá)到1.00 g/L的時(shí)候，鞣花酸的增溶增長(zhǎng)則變得比較緩慢，當(dāng)Tween-20溶液濃度達(dá)到10.00 g/L以上的時(shí)候，鞣花酸的增溶不再隨著Tween-20溶液濃度的增加而增加，甚至出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，可能是由于Tween-20溶液濃度較高時(shí)，溶液粘度較大，同時(shí)Tween-20分子間更易形成氫鍵，從而影響了鞣花酸分子在Tween-20分子聚氧乙烯鏈上的增溶。10.00 g/L的Tween-20溶液中鞣花酸的濃度為238.59 mg/L，相應(yīng)溫度下鞣花酸飽和水溶液的濃度為10.12 mg/L，約為水中溶解的鞣花酸質(zhì)量濃度的24倍，因此，選取10.00 g/L的Tween-20溶液作為鞣花酸的增溶液來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 溫度對(duì)Tween-20溶液增溶鞣花酸的影響 不同溫度下， Tween-20溶液對(duì)鞣花酸的增溶情況見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)鞣花酸在Tween-20溶液中增溶的影響Fig.4 Effect of temperature on solubilization of ellagic acid in Tween-20 solution

由圖4可知，在溫度較低時(shí)隨溫度升高，鞣花酸在Tween-20溶液增溶效果逐漸提高，但增長(zhǎng)不顯著，當(dāng)溫度升高到35 ℃后，鞣花酸的增溶量變化趨緩，說(shuō)明溫度變化對(duì)鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶效果影響不大。在本論文實(shí)驗(yàn)中選擇35 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.5 鞣花酸Tween-20增溶體系的穩(wěn)定性 由圖5可知，鞣花酸Tween-20增溶體系在前8 d的吸光度數(shù)據(jù)較穩(wěn)定，但從第8 d開(kāi)始，吸光度出現(xiàn)驟降，第12 d以后，吸光度開(kāi)始成規(guī)律性緩慢下降。綜上，鞣花酸Tween-20增溶體系在開(kāi)始配制好的一段時(shí)間內(nèi)有較好的穩(wěn)定性，但隨時(shí)間延長(zhǎng)，穩(wěn)定性有所下降。

圖5 鞣花酸Tween-20增溶體系穩(wěn)定性隨時(shí)間的變化Fig.5 Stability of ellagic acid Tween-20 solubilized system with time

2.2 鞣花酸Tween-20增溶體系的抗氧化作用

目前，常用DPPH·、ABTS·、超氧陰離子自由基、羥基自由基等清除實(shí)驗(yàn)及脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)和總抗氧化能力的測(cè)定等方法來(lái)測(cè)定抗氧化性物質(zhì)的體外活性[11]。由于在超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除實(shí)驗(yàn)中要用到FeSO4，而FeSO4易與鞣花酸生成藍(lán)色絡(luò)合物，從而影響測(cè)定結(jié)果，故實(shí)驗(yàn)室常用DPPH·清除[9]、ABTS·清除[10]分析鞣花酸的抗氧化作用[12-13]，本實(shí)驗(yàn)使用酶標(biāo)儀-微孔板法測(cè)定鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)DPPH·、ABTS·的清除能力，并以Vc水溶液為對(duì)比。

2.2.1 鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)ABTS·清除作用 由圖6可知，隨著溶液濃度的增加，鞣花酸Tween-20增溶體系和Vc水溶液均對(duì)ABTS·的清除率增加，在濃度較低的情況下，鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)ABTS·的清除率明顯大于Vc水溶液對(duì)ABTS·的清除率，鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)ABTS·的清除能力的IC50為0.31 mg/L，Vc水溶液的IC50為3.32 mg/L，說(shuō)明鞣花酸作為一種很好的抗氧化活性成分經(jīng)過(guò)表面活性劑增溶后其對(duì)ABTS·的清除能力不會(huì)受到影響，且增溶體系對(duì)ABTS·的清除能力優(yōu)于Vc。

圖6 鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)ABTS·的清除作用Fig.6 Scavenging effect of ellagic acid- Tween-20 solubilizing system on ABTS free radical

2.2.2 鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)DPPH·的清除作用 由圖7可知，隨著鞣花酸和Vc濃度的增加，鞣花酸Tween-20增溶體系和Vc水溶液均對(duì)DPPH·的清除率增加，在濃度較低的情況下，鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)DPPH·的清除率明顯大于Vc水溶液對(duì)DPPH·的清除率，在濃度較高時(shí)，二者清除率相近，鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)DPPH·的清除能力的IC50為0.92 mg/L，Vc水溶液的IC50為2.40 mg/L。說(shuō)明鞣花酸作為一種很好的抗氧化活性成分經(jīng)過(guò)表面活性劑增溶后其對(duì)DPPH·的清除能力不會(huì)受到影響，且增溶體系清除DPPH·的能力優(yōu)于Vc。

圖7 鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)DPPH·的清除作用Fig.7 Scavenging effect of ellagic acid- Tween-20 solubilizing system on DPPH free radical

2.3 鞣花酸增溶體系的表征分析

2.3.1 粒徑及Zeta電位分析 鞣花酸Tween-20增溶體系中粒子的大小及其分布指數(shù)(PDI)見(jiàn)圖8。

圖8 鞣花酸Tween-20增溶體系的粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of Tween-20 solubilized system

由圖8可知，該增溶體系的平均粒徑為(272.5±3.62) nm，PDI為0.230±0.010，Zeta-電位為(-41.57±1.88) mV，其粒徑呈正態(tài)分布，但也存在微量粒徑低于100 nm和高于3 000 nm以上的粒子，同時(shí)其電位的絕對(duì)值較大，說(shuō)明增溶體系的穩(wěn)定性較佳。

2.3.2 透射電鏡形貌觀察 通過(guò)粒徑分析，對(duì)鞣花酸增溶體系的粒徑大小有了大概的推論。為了更加直觀的判斷其微觀結(jié)構(gòu)，采用TEM對(duì)鞣花酸增溶體系中的形態(tài)做更為具體的展示，結(jié)果見(jiàn)圖9。

由圖9可知，鞣花酸增溶體系中不僅發(fā)現(xiàn)了直徑約為40～100 nm(圖9A)、100～1 000 nm(圖9B)的聚集體，也有直徑約為3 000～6 500 nm的大聚集體(圖9C)，該現(xiàn)象與粒徑分布測(cè)試的結(jié)果一致。

圖9 鞣花酸Tween-20增溶體系透射電鏡形貌觀察圖Fig.9 TEM morphology of ellagic acid Tween-20 solubilized system

3 結(jié)論

四種Tween系列非離子表面活性劑溶液對(duì)鞣花酸的增溶效果表明，4種Tween溶液對(duì)鞣花酸都有增溶作用，其中以Tween-20的增溶效果最好，Tween-60的增溶效果最差。

溫度變化對(duì)鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶效果影響不大。在溫度為35 ℃下，Tween-20溶液濃度低于1.00 g/L時(shí)，鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量隨Tween-20溶液濃度的增大而大幅提高，Tween-20溶液濃度介于1.00～10.00 g/L時(shí)，鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量隨Tween-20溶液濃度的增大而增長(zhǎng)趨緩，當(dāng)Tween-20溶液濃度超過(guò)10.00 g/L后，鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量隨Tween-20溶液濃度的增大反而逐漸下降。當(dāng)Tween-20溶液濃度為10.00 g/L時(shí)，鞣花酸增溶濃度達(dá)到了238.59 mg/L，約為鞣花酸飽和水溶液濃度(10.12 mg/L)的24倍。

隨著溶液濃度的增加，鞣花酸Tween-20增溶體系和Vc水溶液均對(duì)ABTS·和DPPH·的清除率增加，在濃度較低的情況下，鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)ABTS·和DPPH·的清除率明顯大于Vc水溶液對(duì)ABTS·和DPPH·的清除率，鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)ABTS·的清除能力的IC50為0.31 mg/L，Vc水溶液的IC50為3.32 mg/L，鞣花酸Tween-20增溶體系對(duì)DPPH·的清除能力的IC50為0.92 mg/L，Vc水溶液的IC50為2.40 mg/L，說(shuō)明鞣花酸經(jīng)過(guò)表面活性劑增溶后其對(duì)ABTS·和DPPH· 的清除能力不會(huì)受到影響。

鞣花酸Tween-20增溶體系的平均粒徑為(272.5±3.62) nm、Zeta-電位為(-41.57±1.88) mV，電位的絕對(duì)值較大，表明其穩(wěn)定性較好。