HPLC-MS/MS法測定魚肉中19種喹諾酮類抗生素的殘留研究

◎ 李盛安，何國成，陳 楠，張益文，劉正華

（1.中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437；2.中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437；3.中山市三鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站，廣東 中山 528463；4.中山市小欖鎮(zhèn)食品綜合快檢中心，廣東 中山 528415）

喹諾酮類（Quinolones，QNs）抗生素長期在我國南方多個(gè)省份淡水養(yǎng)殖行業(yè)中使用。近30年來，隨著我國淡水養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，水產(chǎn)養(yǎng)殖周期、密度增加，由細(xì)菌、真菌引發(fā)的各種魚類疾病頻繁出現(xiàn)，給養(yǎng)殖戶帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。QNs抗生素與其他抗生素（如頭孢類、四環(huán)素等）相比具有價(jià)格低廉、抗菌力強(qiáng)、低毒副作用和易降解等優(yōu)點(diǎn)，加上氯霉素、紅霉素等藥物前后被國家相關(guān)部門禁用，使得QNs抗生素被長期廣泛地應(yīng)用于魚類細(xì)菌性疾病的防治[3]。有研究表明，使用抗生素不僅可以有效抑制致病菌的生長，使得致病菌產(chǎn)生抗性，還會影響微生物群落多樣性，對其他細(xì)菌的活性及生長產(chǎn)生不同程度的影響。例如，非致病菌受到不同程度抑制后，很可能影響水生動物體內(nèi)及養(yǎng)殖水環(huán)境的微生物生態(tài)平衡，導(dǎo)致水環(huán)境日益惡化，引發(fā)新的疾病。水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中殘留的QNs抗生素不僅影響水生動物生長，還會隨養(yǎng)殖尾水排放進(jìn)入下游流域?qū)λh(huán)境產(chǎn)生影響。

常見的檢測QNs抗生素的方法有高效毛細(xì)管電泳法[4]、薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[6]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。魚肉中含有蛋白質(zhì)、脂肪等各種營養(yǎng)成分，多以大分子存在。采用色譜法檢測抗生素殘留時(shí)，由于魚肉樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，會影響色譜峰的出峰時(shí)間及峰型，從而影響抗生素殘留的定性、定量，容易出現(xiàn)假陽性；采用LC-MS/MS檢測魚肉中QNs抗生素殘留，多重反應(yīng)監(jiān)測模式通過采集特征離子數(shù)據(jù)，結(jié)合色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行目標(biāo)化合物的定性、定量，提高了檢測方法的準(zhǔn)確性及靈敏度[7-9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)， 2020年中山市水產(chǎn)養(yǎng)殖面積約為20 666 hm2，年產(chǎn)量約35萬t，主要以淡水池塘養(yǎng)殖四大家魚為主。中山市是廣東省水產(chǎn)養(yǎng)殖大市，市內(nèi)有多家供港澳食用農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)基地，其產(chǎn)品在港澳市場深受市民喜愛，中山區(qū)域承擔(dān)著港澳淡水魚水產(chǎn)品供應(yīng)的重任。因此，在中山市開展魚肉中QNs抗生素殘留檢測具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高速冷凍離心機(jī)（SIGMA公司）；勻漿機(jī)（IKA公司）；電子天平（Precisa公司）；MULTIVAPTM118 氮吹儀（Organomation公司）；XW-80A旋渦混合器（上海精科）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI公司）；A10超純水純化系統(tǒng)（Millipore公司）；0.22 μm有機(jī)濾膜（天津津騰）；1200-G6495液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent公司）。

甲醇、甲酸均為色譜純（Merck公司）；麻保沙星、吡哌酸、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、單諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、奧索利酸、西諾沙星、氟甲喹、萘啶酸、奧比沙星、氟羅沙星和司帕沙星（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 溶液配制

分別稱取適量上述標(biāo)準(zhǔn)品，先用甲醇溶解后定容于100 mL容量瓶中，此時(shí)各組分單標(biāo)儲備液濃度為 1 000 mg·L-1，于4 ℃下避光保存。再將各組分單標(biāo)儲備液稀釋后配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：40 ℃；流動相：A為0.1%的甲酸水溶液，B為甲醇溶液，流速為0.4 mL·min-1；分離19種QNs抗生素的流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件表

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：ESI+；干燥氣溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；干燥氣流速：14 L·min-1；霧化器壓力：30 psi；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測；各抗生素組分離子對及碎裂電壓、碰撞能量及保留時(shí)間見表2。

表2 19種QNs抗生素測定的質(zhì)譜測定條件參數(shù)表

1.4 樣品處理

活魚現(xiàn)宰去鱗腮，取魚肉部分清洗干凈后晾干表面水分，魚肉攪碎后稱取5 g魚肉樣品置于50 mL具塞離心管中，加入2 mL EDTA-Macllvaine緩沖溶液，渦旋混合30 s，避光放置10 min。往具塞離心管中加入20 mL 1.0%甲酸乙腈，8 000 r·min-1均質(zhì)2 min，再加入10 g無水Na2SO4，離心管擰緊蓋子渦旋混合 60 s，設(shè)置離心機(jī)溫度為-4 ℃，以10 000 r·min-1離心3 min，將上清液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中。再往具塞離心管加入20 mL 1.0%甲酸乙腈，渦旋混合30 s，重復(fù)提取一次，將上述兩次提取液合并，設(shè)置溫度為50 ℃、真空度為80 kPa，調(diào)整適當(dāng)轉(zhuǎn)速將提取液在水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干，用2 mL 20%甲醇溶液解殘?jiān)?，再加? mL正己烷渦旋混合30 s，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中的溶液吸出置于離心管中，再在-4 ℃，以10 000 r·min-1離心3 min，吸取下清液過0.22 μm濾膜，上機(jī)待測。同時(shí)，做樣品空白試驗(yàn)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

使用基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行外標(biāo)法定量，可以有效消除樣品基質(zhì)對抗生素組分的干擾。本文采用不含QNs抗生素的魚肉空白基質(zhì)溶液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為1 μg·L-1、2 μg·L-1、 5 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的系列QNs基質(zhì)配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混標(biāo)溶液過 0.22 μm濾膜，上機(jī)待測。以各抗生素組分定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)混標(biāo)溶液的濃度為橫坐標(biāo)計(jì)算編制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，做基質(zhì)空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

考慮到魚肉中含有大量的蛋白質(zhì)及脂肪等大分子，在提取QNs抗生素時(shí)干擾物質(zhì)較多。實(shí)驗(yàn)分別選取氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和西諾沙星等5種具有代表性的QNs抗生素，按照本文1.4樣品處理方法，在稱取5 g魚肉樣品后加入上述5種QNs抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加QNs抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后擰緊蓋子后放置于4 ℃條件下過夜，各組分的濃度分別為20 ng·mg-1、50 ng·mg-1，同時(shí)進(jìn)行3個(gè)樣品的平行實(shí)驗(yàn)。對比乙腈、乙酸乙酯、1.0%甲酸甲醇和1.0%甲酸乙腈溶液4種提取液，分析上述4種提取液的加標(biāo)回收率，發(fā)現(xiàn)1.0%甲酸乙腈溶液提取效果相對優(yōu)于其他提取液。最終本文采用了1.0%甲酸乙腈溶液為提取液，結(jié)果如表3所示。

表3 不同提取液對QNs抗生素的回收率表

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

在實(shí)驗(yàn)方法1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制有基礎(chǔ)上，以各抗生素組分的特征離子色譜峰3倍信噪比（S/N＞3）為方法檢出限，標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)R2及各組分檢出限見表4。19種QNs抗生素在1～200 μg·L-1呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.998 0，能滿足日常水產(chǎn)品中19種QNs抗生素殘留監(jiān)測的需要。

表4 19種QNs抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及檢出限表

2.3 方法回收率和精密度

稱取不含QNs抗生素的魚肉于50 mL具塞離心管中，添加10 ng·mg-1、20 ng·mg-1、60 ng·mg-1的19種QNs抗生素進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，添加QNs抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后擰緊蓋子后放置于4 ℃條件下過夜，同時(shí)進(jìn)行3個(gè)樣品的平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。由表5可知， 19種QNs抗生素的加標(biāo)回收率在69.23%～96.28%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.28%～9.86%，方法具有較好的精密度和回收率。

表5 魚肉中19種QNs抗生素的平均加標(biāo)回收率與精密度表

2.4 實(shí)際樣品的測定

采用本文建立的檢測方法對中山市水產(chǎn)養(yǎng)殖漁塘中35個(gè)魚肉樣品（其中烏鱧7個(gè)、鳙魚9個(gè)、羅非魚9個(gè)以及草魚10個(gè)）進(jìn)行測定，結(jié)果表明19種QNs抗生素均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中多種QNs抗生素殘留的監(jiān)測方法。該方法具有分析時(shí)間短、操作簡單、定性準(zhǔn)確性高及檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1077號公告—1—2008）中包括了15種喹諾酮類的檢測方法，但標(biāo)準(zhǔn)的分析時(shí)間較長。本文對前處理提取液進(jìn)行優(yōu)化，方法具有較好的精密度和回收率，能滿足日常大批量監(jiān)測的需要。