箱線圖在山梨酸定量測定能力驗(yàn)證結(jié)果 分析中的應(yīng)用

◎ 姚澤平，黎佩錦，蔡若純，蔡海華，林騰奕，劉小玉

（廣東省食品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510435）

箱線圖，又稱箱圖、箱形圖、箱絲圖、盒須圖和盒式圖，是一種直接表現(xiàn)變量分布情況的統(tǒng)計(jì)模型圖形，利用它可以以較為直觀的視角觀察數(shù)據(jù)的分布情況，箱線圖對(duì)于顯示變量的分布情況并確定離群值的位置非常有用[1-2]。箱線圖技術(shù)是將數(shù)據(jù)集以四分位數(shù)的形式拆分，通過找到中位數(shù)的上四分位數(shù)、下四分位數(shù)以剔除數(shù)據(jù)集中的異常值[3]。箱線圖中的中位數(shù)、四分位間距是箱線圖用來顯示數(shù)據(jù)中心和分布的元素[4]。除了箱線圖，檢驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)中異常離群值的常用方法還有3σ法、格拉布斯法等。相比之下，箱線圖可以應(yīng)用于正態(tài)分布樣本數(shù)據(jù)異常值判斷，也可以應(yīng)用于非正態(tài)分布樣本數(shù)據(jù)異常值判斷。因此，箱線圖在統(tǒng)計(jì)分析中已得到廣泛應(yīng)用，THIRUMALAI等[5]應(yīng)用箱線圖分析肺癌數(shù)據(jù)；代斌[6]應(yīng)用箱線圖法的PSO-SVM研究小麥種子的分類；LIN等[7]應(yīng)用箱線圖挖掘RBM8A在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；趙穎祺等[8]提出一種基于箱線圖的SAR圖像艦船研究的檢測算法；谷劍芳[9]應(yīng)用LSTM、RFM算法和箱型圖探討了電子社?？ㄔ诨ヂ?lián)網(wǎng)中的行為。

山梨酸是一種食品添加劑，是目前在國際上使用較為廣泛的防腐劑。它有較強(qiáng)的抑菌作用，能夠阻止真菌的繁殖生長。山梨酸具有抑制微生物內(nèi)部脫氫酶系統(tǒng)的特性，通過抑制脫氫酶系統(tǒng)阻止微生物的生長繁殖，從而起到防腐的作用，常在藥品、化妝品、動(dòng)物飼料、橡膠助劑以及包裝材料中得到應(yīng)用[10-11]。我國GB 2760—2014對(duì)不同類別食品中山梨酸的限量作出了明確規(guī)定[12]。

能力驗(yàn)證是一種通過實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，按照標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)則評(píng)估參與者能力的活動(dòng)[13]。能力驗(yàn)證活動(dòng)可評(píng)估實(shí)驗(yàn)室特定的檢驗(yàn)測量能力，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室存在的不足，建立檢驗(yàn)方法的可比性和有效性，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室提升檢驗(yàn)測量質(zhì)量，有助于所參與實(shí)驗(yàn)室提高檢測能力[14]。因此，參加能力驗(yàn)證項(xiàng)目的結(jié)果值能反映實(shí)驗(yàn)室的檢測水平。在能力驗(yàn)證活動(dòng)中，參與機(jī)構(gòu)除了具有一定的檢驗(yàn)檢測水平，對(duì)于檢驗(yàn)結(jié)果的分析確定也應(yīng)值得重視。

為進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)食品中山梨酸的定量測定檢測水平，實(shí)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制計(jì)劃，本實(shí)驗(yàn)室參加了2020年度FAPAS 20172“巧克力蛋糕中的山梨酸”能力驗(yàn)證活動(dòng)，通過建立一種箱線圖分析流程圖，確定樣品中山梨酸含量值。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甲醇（HPLC，4 L，默克）、乙酸銨（HPLC，500 g/瓶， FISHER）、實(shí)驗(yàn)用水（電導(dǎo)率為0.55 μS·cm-1，25 ℃，均通過Milli-Q超純水機(jī)制備）、亞鐵氰化鉀（分析純，500 g，廣試）、乙酸鋅（分析純，500 g，廣試）；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：110-44-1，500 mg，CATO）；色 譜柱：Waters XBridge C18，250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 儀器與設(shè)備

萬分之一電子天平（瑞士梅特勒LE303E）；10 mL容量瓶（天玻，A級(jí)）；50 mL容量瓶（天玻，A級(jí)）；100 mL容量瓶（天玻，A級(jí)）；Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)（德國Merck公司）；超聲系統(tǒng)（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；高效液相色譜儀（美國沃特世ACQUITY ARC）；移液器（100 μL、1 mL、5 mL）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 箱線圖分析流程的建立

在能力驗(yàn)證活動(dòng)中，能力驗(yàn)證提供者可采用經(jīng)典的統(tǒng)計(jì)方法來確定能力驗(yàn)證樣品的標(biāo)準(zhǔn)值和標(biāo)準(zhǔn)差。能力驗(yàn)證提供者可采用格拉布斯準(zhǔn)則來剔除離群值后計(jì)算樣本的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以均值作為標(biāo)準(zhǔn)值，以標(biāo)準(zhǔn)差作為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差；也可以采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法。穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法在能力驗(yàn)證實(shí)際活動(dòng)中應(yīng)用更加廣泛，更加靈活，不需要剔除樣本數(shù)據(jù)中的離群值[15-16]。而對(duì)于能力驗(yàn)證活動(dòng)參加者，能力驗(yàn)證樣品的含量值如何確定卻沒有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)。能力驗(yàn)證參加者在實(shí)際能力驗(yàn)證活動(dòng)過程中，往往采用多種質(zhì)控措施，如人員比對(duì)、儀器比對(duì)、方法比對(duì)、質(zhì)控樣試驗(yàn)和加標(biāo)回收等[17]，以提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，這樣可得到多組實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)。然而，質(zhì)控樣試驗(yàn)、加標(biāo)回收率，變異系數(shù)等指標(biāo)，對(duì)組內(nèi)數(shù)據(jù)中是否存在異常值并不敏感。因此，可從整體考慮分析所有數(shù)據(jù)，運(yùn)用箱線圖尋找剔除數(shù)據(jù)樣本中的離群值，減少結(jié)果的偏離程度。最后根據(jù)樣本數(shù)據(jù)的分布類型選擇合適的集中趨勢特征值作為含量值。箱線圖具體分析流程如圖1所示。

圖1 箱線圖分析流程圖

1.3.2 溶液的配制

（1）乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）配制。準(zhǔn)確稱取乙酸銨1.54 g于燒杯中，加入適量水溶解后轉(zhuǎn)移定容至1 L，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。

（2）山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 000 mg·L-1）配制。準(zhǔn)確稱取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g（精確至0.000 1 g），用水溶解定容至100 mL容量瓶中，于4 ℃貯存。

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱量約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL離心管中，加入超純水約25 mL，充分渦旋，混合均勻，置于50 ℃水浴中超聲20 min，冷卻至室溫，依次加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2 mL，搖勻，離心5 min， 將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于離心管殘?jiān)屑尤?0 mL超純水，重復(fù)提取一次后將水相轉(zhuǎn)移至同一 50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。吸取適量上清液，0.22 μm濾膜過濾，濾液待液相色譜測定。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍和樣品稀釋倍數(shù)

20172樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，用GB/T 5009.28—2016（第一法）測得樣品的山梨酸含量水平在700～900 mg·kg-1， 其儀器讀取濃度在28～36 mg·L-1。再結(jié)合加標(biāo)濃度考慮，樣品溶液最大濃度可到75 mg·L-1。故標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、 50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1。

1.3.5 質(zhì)量控制措施

為進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本次參加的能力驗(yàn)證活動(dòng)，根據(jù)20172 試樣的山梨酸的含量水平、實(shí)驗(yàn)儀器、方法選擇以及本實(shí)驗(yàn)室的條件，對(duì)山梨酸的含量測定使用以下質(zhì)量控制措施，即平行實(shí)驗(yàn)、加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)、質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)、儀器比對(duì)和人員比對(duì)。質(zhì)量控制措施的具體實(shí)施內(nèi)容如下。

（1）精密度實(shí)驗(yàn)。采用7平行測定，即稱取7份樣品進(jìn)行測定分析，計(jì)算平行結(jié)果的變異系數(shù)，分析每組測定結(jié)果的精密度。共3名實(shí)驗(yàn)人員，每人均進(jìn)行7次平行測定。

（2）加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)水平一般為樣品含量水平的0.5～2.0倍，而20172樣品的山梨酸含量水平為700～900 mg·kg-1，所以合適的加標(biāo)水平為 450～1 400 mg·kg-1；取樣量按2.0 g來計(jì)算，以此對(duì)應(yīng)的樣品加標(biāo)量為0.9～2.8 mg。本實(shí)驗(yàn)以16 mg為實(shí)際加標(biāo)量進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，通過測定并計(jì)算加標(biāo)回收率來分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。共3名實(shí)驗(yàn)人員，每人均進(jìn)行2次加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

（3）質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)選用山梨酸含量與20172樣品比較接近的蛋糕中的山梨酸質(zhì)控樣品（ZKY2930，基質(zhì)：巧克力蛋糕50 g）進(jìn)行測定，評(píng)估能力驗(yàn)證樣品測定過程中的準(zhǔn)確性。共3名實(shí)驗(yàn)人員，每人均進(jìn)行2次質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)。

（4）儀器比對(duì)和人員比對(duì)。比對(duì)實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，對(duì)美國沃特世（ACQUITY ARC）以及日本島津（Prominence UFLCXR）兩種不同品牌的儀器進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)GB/T 5009.28—2016（第一法）進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)人員間的測定結(jié)果比對(duì)。運(yùn)用實(shí)驗(yàn)人員間的比對(duì)實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)人員、檢測方法和儀器性能的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

稱量7份20172樣品按以上實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。GB/T 27404—2008要求1 000 mg·kg-1含量水平的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)為3.8%[18]，本次實(shí)驗(yàn)3組人員測定結(jié)果的變異系數(shù)都小于3.8%，均符合GB/T 27404— 2008的要求。從變異系數(shù)結(jié)果分析，無法判斷各組實(shí)驗(yàn)人員的測定結(jié)果是否存在異常值。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2 加標(biāo)回收與質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

稱取兩份20172樣品，加入適量山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，前處理測定步驟與樣品一致，計(jì)算加標(biāo)回收率。稱取山梨酸質(zhì)控樣品ZKY2930與20172樣品同時(shí)進(jìn)行前處理和上機(jī)測定。加標(biāo)回收率與質(zhì)控樣品的測定結(jié)果如表2所示。由表2可知，3組人員的質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)均為滿意。GB/T 27404—2008要求1 000 mg·kg-1含量水平的加標(biāo)回收率為95%～105%，實(shí)驗(yàn)人員B有一個(gè)加標(biāo)回收率為92.1%，小于95%，不滿足 GB/T 27404—2008的要求。加標(biāo)回收率過低有可能是該次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)操作存在異常，也有可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)人員B的平行測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高，從加標(biāo)回收與質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法確定原始數(shù)據(jù)是否存在異常值。

表2 加標(biāo)回收與質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3 箱線圖結(jié)果分析

用Origin 2018將精密度實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)看作一個(gè)整體繪制箱線圖，如圖2所示。由圖2可知，實(shí)驗(yàn)人員B有一個(gè)原始數(shù)據(jù)864為離群值，故將其剔除。

圖2 山梨酸原始數(shù)據(jù)箱線圖

將剔除異常值后的數(shù)據(jù)再次繪制箱線圖判斷是否有離群值，此時(shí)已無離群值，詳見圖3。

圖3 山梨酸處理數(shù)據(jù)箱線圖

2.4 山梨酸含量的確定

剔除異常值后原始數(shù)據(jù)還有20個(gè)，假設(shè)樣本數(shù)據(jù)來自正態(tài)總體，且樣本量N較?。?≤N≤50），故采用Shapiro-Wilk的W統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的正態(tài)性[19]，計(jì)算得到P=0.079＞0.05，不拒絕原假設(shè)，認(rèn)為數(shù)據(jù)總體呈近似正態(tài)分布。由于樣本數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，故在集中趨勢特征值中，選取平均值為816 mg·kg-1作為山梨酸的含量值。

2.5 山梨酸含量的評(píng)價(jià)

本次FAPAS能力驗(yàn)證07300共計(jì)42家實(shí)驗(yàn)室參與，其中有33家實(shí)驗(yàn)室參與了山梨酸結(jié)果統(tǒng)計(jì)，山梨酸含量的指定值為837 mg·kg-1，本實(shí)驗(yàn)室最終結(jié)果值為816 mg·kg-1，Z值為-0.4（圖4，實(shí)驗(yàn)室代碼為38）， 能力驗(yàn)證結(jié)果滿意。

圖4 FAPAS 20172中山梨酸的Z值分布柱狀圖

3 結(jié)論

在本次能力驗(yàn)證中，對(duì)20172樣品的山梨酸含量測定結(jié)果為816 mg·kg-1，Z值為-0.4，結(jié)果滿意。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對(duì)于能力驗(yàn)證樣品山梨酸含量的測定結(jié)果，通過建立箱線圖分析流程可以分析原始數(shù)據(jù)的離群情況，選取合適的集中趨勢特征值確定為含量值，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。該方法準(zhǔn)確、可靠，可為能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)估提供一種分析方法。