醬油中可培養(yǎng)抗逆微生物研究進展

◎ 楊 勇，趙陽娟，劉 希，童 星

（1.廣東海天創(chuàng)新技術有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；3.佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528511）

醬油是一種美味的傳統(tǒng)調(diào)味品，兩千多年前古代中國人民就掌握了醬油的生產(chǎn)釀造方法，從此以后它與人們的生活息息相關。醬油發(fā)酵是一個多種類微生物（包括霉菌、酵母、細菌等）共同對大豆和小麥等原料進行天然發(fā)酵的過程。經(jīng)過微生物及其所產(chǎn)酶系的長期、共同作用，使得醬油具有獨特的風味和豐富的營養(yǎng)價值[1]。

微生物群落組成對于醬油的發(fā)酵過程和風味物質(zhì)合成具有重要影響，傳統(tǒng)醬油發(fā)酵過程中微生物的多樣性賦予其獨特的酯香味和醬香味，然而醬油中食鹽、酒精等物質(zhì)含量較高，嚴重威脅微生物生長，本文總結(jié)了近年來國內(nèi)外對醬油抗逆微生物的分離鑒定成果，希望為醬油的創(chuàng)新研究工作提供思路，為擴充醬油釀造微生物種質(zhì)資源庫和改善醬油風味提供幫助。

1 醬醪中的主要微生物

從醬油生產(chǎn)中分離得到的微生物種類繁多，主要有霉菌、酵母菌以及細菌（主要是乳酸菌）3大類。醬油制曲階段主要是霉菌（最主要是米曲霉Aspergillus oryzae）起作用，它在醬油釀造中起到重要作用。酵母菌在醬油發(fā)酵過程中主要起增香作用，由此增加了醬油風味。乳酸菌能產(chǎn)生大量的有機酸。有機酸的大量存在不僅對有害微生物的生長有一定的抑制作用，同時為魯氏接合酵母的生長繁殖提供條件，而且這些有機酸既是醬油的風味成分，又是其他酯香類物質(zhì)的前體，極大地豐富了醬油風味[2]。

近年來，有國內(nèi)外學者通過宏基因組學等分子生態(tài)學的方法研究了醬醪中微生物的結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)還有大量其他未被報道的微生物，尤其是大量的細菌參與醬油發(fā)酵。研究結(jié)果顯示，這些細菌的種群總量多、豐度大，但是它們在醬油生產(chǎn)中具有的特性和功能尚不十分清楚[3]。

我國目前的醬油生產(chǎn)商品化菌種資源相對匱乏，無法解決隨著生活水平的提高，人們對醬油產(chǎn)品個性化的需求和健康、天然的品質(zhì)要求也在逐漸增加這一矛盾[4]。而對于研究者而言，就應該不斷去發(fā)現(xiàn)醬油生產(chǎn)過程中的微生物以及探究它們在發(fā)酵過程中的功能角色。

2 依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法分離醬油抗逆微生物

綜合前期的研究發(fā)現(xiàn)，早期醬油抗逆微生物的分離鑒定研究重點在于霉菌和酵母，而對生產(chǎn)過程中存在的耐鹽細菌研究相對較少[5]。近年來，隨著國內(nèi)外學者對醬油生產(chǎn)中微生物群落結(jié)構(gòu)研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)其中的微生物不僅生物量大而且種類豐富，然而它們在醬油高鹽逆境中具有的功能有待進一步研究。目前國內(nèi)外學者不斷報道分離自醬油抗逆微生物以及它們的生物學功能，這對醬油生產(chǎn)微生物菌種庫的擴充、對其他進行類似研究的學者們是一種鼓勵。

2.1 抗逆細菌

表1對近年來國內(nèi)外學者從醬醪中分離鑒定的微生物進行了統(tǒng)計。

表1 醬油發(fā)酵過程中分離鑒定的耐鹽微生物表

從表1各文獻中可以看出，不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)方法、不同發(fā)酵時間、甚至是不同批次的醬醪中分離得到的抗逆細菌是不盡相同的。各地學者分離鑒定到的抗逆細菌有Weissella（W. paramesenteroides）、Pediococcus（P. halophilus、P. acidilactici、P. pentosaceus）、Staphylococcus（Staph. kloosii、Staph. gallinarum、Staph.condimenti、Staph. cohnii、Staph. vitulus、Staphy. saprophyticus、Staph. epidermidis、Staph. xylosus）、Tetragenococcus（T. halophilus）、Enterococcus（E. faecium）、Bacillus（B. amyloliquefaciens、B.licheniformis、B. pumilus、B. subtilis、B. sonorensis、B. cereus、B. methylotrophicus）、Micrococcus、Aerococcus、Lactobacillus（L. fermentum、L. acidipiscis、L. farciminis、L. pentosus、L. plantarum）、Delftia（D.tsuruhatensis）和coryneform bacteria等。其中大多數(shù)分離到的抗逆微生物均未能考察其在醬油生產(chǎn)中的功能。YANG[7]、謝小保等[9]分別對中國醬油、WEI等[19]對中國醬油、TANASUPAWAT等[15]對泰國醬油中的耐鹽細菌做了系統(tǒng)性的分離鑒定工作。另外國內(nèi)的研究機構(gòu)江南大學近些年也不斷有相應的研究成果 報道。

在醬油中被廣泛報道的細菌有乳酸菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬等。乳酸菌包括魏斯氏菌屬（Weissella）等[21]，它是一類能利用各類糖類化合物作為產(chǎn)物生成底物乳酸的細菌的總稱，醬油發(fā)酵中的乳酸菌通常還具有耐受高鹽（至少8%，見表1）這一普通乳酸菌不具備的性質(zhì)，通過在發(fā)酵環(huán)境中產(chǎn)生有機酸及分泌肽類物質(zhì)，如抑菌肽，將醬醪體系轉(zhuǎn)變?yōu)槠岬沫h(huán)境，能在一定程度上抑制雜菌的生長，有利于一些酵母的生長及代謝。

趙國忠等[13]將從老廠醬醪中分離到的一株耐鹽植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）添加到醬油發(fā)酵中，氣相色譜-質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示添加了這株植物乳桿菌后，發(fā)酵醬油中酮類、酚類和醇類等物質(zhì)增加顯著。另外，該醬油總酸、氨基態(tài)氮、可溶性無鹽固形物這3項指標都有顯著提高，其中包括乳酸含量，而其他有機酸含量略有下降。同時結(jié)果表明該植物乳桿菌可促進生成更多的單糖、氨基酸、乳酸等小分子化合物，從而增強醬油的風味。此研究為今后醬油的品質(zhì)改良打下良好的理論基礎。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中魏斯氏菌廣泛存在，具有較高的應用價值。胡傳旺[6]通過對高鹽稀態(tài)醬油中耐鹽細菌的代謝產(chǎn)物進行分析時發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌在高鹽（18%）培養(yǎng)條件下均能水解原料，產(chǎn)生較多的鮮味氨基酸。李巧玉等[12]發(fā)現(xiàn)，12株從醬油中得到的魏斯氏菌在高鹽培養(yǎng)條件下，有1株可降解利用多種生物胺，有3株菌反而會產(chǎn)生生物胺，不過大多數(shù)菌株不產(chǎn)生物胺。另外結(jié)果顯示這12株魏斯氏菌在高鹽體系中均能生成多種有機酸和多種胞外多糖等功能性物質(zhì)，從而改善醬油的口感和營養(yǎng)。

楊怡敏[22]發(fā)現(xiàn)乳酸足球菌（Pediococcus acidilactici） BBE 1120能夠積累瓜氨酸，而且正是因為高鹽環(huán)境、碳源種類及濃度等因素引起該微生物積累瓜氨酸，其中高鹽是最主要因素。通過比較不同來源的乳酸足球菌菌株，發(fā)現(xiàn)這些乳酸足球菌在18%鹽濃度條件下，利用底物精氨酸生成產(chǎn)物瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率是有差異的，對高鹽耐受性強的菌株的轉(zhuǎn)化率相對較低。作者分別對不同菌株產(chǎn)生物胺的能力進行了定性和定量分析，結(jié)果表明該菌不產(chǎn)測定的8種生物胺。此外通過分析發(fā)現(xiàn)，乳酸足球菌能夠在高鹽環(huán)境下降解8種生物胺。

胡傳旺[6]發(fā)現(xiàn)嗜鹽四聯(lián)球菌（T. halophilus）不僅會產(chǎn)生大量的有機酸，而且還會產(chǎn)生較多的揮發(fā)性物質(zhì)。楊希飛[23]發(fā)現(xiàn)嗜鹽四聯(lián)球菌可代謝瓜氨酸（它是由精氨酸脫亞氨酶途徑產(chǎn)生）和氨基甲酸乙酯。接入嗜鹽四聯(lián)球菌對于醬油風味的提升有意義，而且醬油中的各類風味物質(zhì)（酸、醛、酮、酯、酚和吡嗪類等物質(zhì)）的含量也分別比對照提高不少。

另外葡萄球菌作為風味細菌在發(fā)酵肉制品中應用較多，其本身具有很強的耐高鹽能力，容易馴化。胡傳旺等[24]從醬油中分離得到一株葡萄球菌JY09，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)較多。

芽孢桿菌的蛋白酶及淀粉酶一般酶活較高，有利于醬油中蛋白質(zhì)及淀粉的分解。PALANIYANDI等[25]從韓國醬油（Ganjang）中分離到了一株索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis），發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)胞外多糖的能力突出，可抑制一些病原微生物的生長，可以作為益生菌，但該研究未對其在醬油發(fā)酵中的功能進行考察。JIANG等[8]從天然曬露法釀制醬油中分離鑒定了一株耐鹽枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），發(fā)現(xiàn)其在醬油發(fā)酵過程中具有改善醬油香氣的作用，香氣成分中的酚、酮、酯均有不同程度的增加。

醬油風味細菌的研究起步較晚，在生產(chǎn)中的應用程度較淺。此外，尚有許多風味細菌未被應用或發(fā)現(xiàn)，這需要此領域內(nèi)的學者們進行更加深入的研究。

2.2 抗逆酵母

Candida（C. parapsilosis、C. etchellsii、C. guilliermondii var. membranaefaciens、C. famata、C. pulcherrima、C. lusitaniae、C. orthopsilosis）、Debaromyces（D. hansenii var. fabryi）、Sterigmatomyces、Meyerozyma（M. guilliermondii）、Torulopsis、Saccharomyces、Trichosporon、Cryptococcus（C. albidus）、Microbotryum（M. violaceum）、Pichia（P. guilliermondii、P.sorbitophila）、Rhodotorula（R. mucilaginosa、R. glutinis）、Tetrapisispora（T. blattae）、Torulaspora（T.delbrueckii）、Wickerhamomyces（Wickerhamomyces. anomalus）等酵母得到了分離鑒定。其中，馮杰[14]將分離到的C. etchellsii添加到醬油的發(fā)酵生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)它對于醬油的質(zhì)量和風味具有顯著的促進作用。結(jié)果表明，氨基態(tài)氮和可溶性無鹽固形物含量分別達到（9.15±0.12）g·L-1和（269.60±3.15）g·L-1，相較于對照分別增加了23.1%和17.6%。樣品中最高的游離氨基酸含量和39種揮發(fā)性風味化合物總量分別達到（58.21±1.77）g·L-1和（17.81±0.45）g·L-1，相較于對照分別提高了1.76%和178.7%。醬油中的典型風味物質(zhì)，如4-乙基愈創(chuàng)木酚和HEMF等物質(zhì)均有所增加，更好地促進了醬油風味質(zhì)量的改善和提高。

YANG等[7]和ARYUMAN等[16]兩個不同的團隊各自從醬油中分離到了季也蒙念珠菌（Meyerozyma guilliermondii）這類耐鹽酵母。YANG等還從醬油中檢測出10種特征香氣成分，包含醛、酮、醇、酸和酯等不同的化合物，這10種化合物中主要的、能夠為醬油的特征風味帶來積極影響的揮發(fā)性物質(zhì)分別為2-苯基乙醇和3-甲基-1-丁醇。而ARYUMAN等分離到的季也蒙念珠菌還能產(chǎn)生谷氨酰胺酶，而且酶活隨著鹽濃度的增大而增大，在18%高鹽濃度下達到最大，可見高鹽環(huán)境下該酵母可以使底物L-谷氨酰胺生成產(chǎn)物L-谷氨酸的水解反應加速，對醬油產(chǎn)品鮮味的提升具有重要作用。因此兩個團隊均認為該類酵母具有進一步添加到醬油生產(chǎn)中去提升醬油品質(zhì)的 價值。

3 結(jié)語

長期以來人們對傳統(tǒng)食品發(fā)酵行業(yè)的基礎研究不夠重視，對醬油生產(chǎn)中的抗逆微生物分離、鑒定、選育方面的研究相對滯后，尤其是對其中的細菌的研究相對較少，這不利于研究醬油發(fā)酵體系中的微生物群落組成以及各自的角色功能。但隨著生活水平的不斷提高，人們對高品質(zhì)醬油的需求也越來越大。這也為醬油釀造行業(yè)帶來了新的發(fā)展契機。

消費者對醬油品質(zhì)的追求促進了高品質(zhì)醬油釀造工藝的發(fā)展，醬油抗逆微生物的研究及其應用成為推動工藝發(fā)展的重要途徑，也將成為研究的熱點之一。各種耐鹽細菌與主發(fā)酵菌種在長期發(fā)酵中相互作用，代謝產(chǎn)生的各種物質(zhì)相互反應，構(gòu)成了醬油復雜的風味物質(zhì)體系，從而形成了醬油特有的風味。隨著高通量測序、基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學及代謝組學等現(xiàn)代生物技術的應用，深入研究醬油抗逆微生物、擴大其應用優(yōu)勢、發(fā)掘其在釀造中的應用潛力、實現(xiàn)多菌種混合發(fā)酵及優(yōu)化醬油風味，將為生產(chǎn)安全健康、鮮咸適口、醬香醇厚的優(yōu)質(zhì)醬油提供有力保障。