小鼠葡萄糖鉗夾技術(shù)方法的建立與操作

龔穎蕓，付真真，周紅文

實(shí)驗(yàn)操作指南

小鼠葡萄糖鉗夾技術(shù)方法的建立與操作

龔穎蕓，付真真，周紅文

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南京 210029

葡萄糖代謝是機(jī)體能量代謝的核心，在各個(gè)組織器官發(fā)揮能量供應(yīng)及代謝調(diào)控作用，胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一的降糖激素。胰島功能及胰島素敏感性是影響葡萄糖代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。葡萄糖鉗夾技術(shù)是評(píng)估胰島素敏感性及胰島功能的金標(biāo)準(zhǔn)，主要類別包括高胰島素正糖鉗夾、高糖鉗夾、高胰島素低糖鉗夾等類型。在小鼠葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中根據(jù)是否麻醉分為麻醉和清醒狀態(tài)鉗夾。本文重點(diǎn)闡述了小鼠葡萄糖鉗夾技術(shù)方法的建立及操作的具體流程，包括器械耗材的準(zhǔn)備、手術(shù)操作、鉗夾過程及注意事項(xiàng)，旨在為實(shí)驗(yàn)室搭建各類小鼠葡萄糖鉗夾技術(shù)平臺(tái)提供參考。

高胰島素正糖鉗夾；高糖鉗夾；高胰島素低糖鉗夾；胰島素敏感性；胰島功能

葡萄糖代謝是機(jī)體能量代謝的中心環(huán)節(jié)，全身各個(gè)器官組織中絕大多數(shù)細(xì)胞依賴葡萄糖供能從而維持正常的生理代謝，甚至對(duì)大腦、紅細(xì)胞而言葡萄糖是唯一的能量來源。正常狀態(tài)下，血糖水平在多個(gè)環(huán)節(jié)受到調(diào)控，包括食物中糖分的直接吸收、其他非糖物質(zhì)的生糖轉(zhuǎn)換、糖原的分解以及細(xì)胞攝取利用葡萄糖產(chǎn)能等，使血糖水平維持在一個(gè)精密穩(wěn)定的范圍內(nèi)。胰島素作為體內(nèi)唯一的降糖激素，其含量異常或功能紊亂是血糖代謝失衡的中心環(huán)節(jié)。1979年，美國(guó)Ralph A. DeFronzo教授創(chuàng)立了葡萄糖鉗夾技術(shù)[1]，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及臨床藥物研發(fā)中，被視為人體研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中評(píng)估胰島素敏感性及胰島功能的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于葡萄糖鉗夾技術(shù)具有操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)操作人員資質(zhì)及技術(shù)要求高等特殊性，限制了其普遍推廣。人葡萄糖鉗夾技術(shù)主要應(yīng)用于評(píng)估胰島素敏感性及胰島功能的臨床研究中，也可用于評(píng)價(jià)新型胰島素制劑的藥物代謝動(dòng)力學(xué)及藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)。本文基于課題組長(zhǎng)期積累的實(shí)施經(jīng)驗(yàn)，圍繞小鼠模型中清醒和麻醉狀態(tài)下葡萄糖鉗夾技術(shù)方法的建立展開介紹。不同類別鉗夾技術(shù)在一些細(xì)節(jié)上略有不同，本文將對(duì)異同點(diǎn)作詳細(xì)分類闡述。此外，同位素輔助的小鼠葡萄糖鉗夾有助于單獨(dú)評(píng)估各個(gè)代謝器官對(duì)葡萄糖的攝取及代謝能力，但由于同位素的采購(gòu)及使用有其特殊要求，導(dǎo)致該方法的使用受到限制，故在此文中不做詳細(xì)論述。

1 小鼠葡萄糖鉗夾的種類及應(yīng)用

1.1 小鼠高胰島素正糖鉗夾

高胰島素正糖鉗夾技術(shù)(又稱胰島素鉗夾)，是評(píng)估全身胰島素敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)，如配合使用同位素示蹤技術(shù)可進(jìn)一步定量評(píng)估胰島素對(duì)內(nèi)源性葡萄糖生成的抑制作用，還可計(jì)算各個(gè)代謝組織對(duì)葡萄糖的利用情況，從而判斷基礎(chǔ)及胰島素負(fù)荷后肝臟葡萄糖的輸出情況，比較胰島素在肝臟、肌肉、脂肪等代謝器官的敏感性情況，尤其是在基礎(chǔ)研究中開展組織特異性葡萄糖代謝的研究工作具有重要價(jià)值，但限于同位素相關(guān)實(shí)驗(yàn)存在技術(shù)準(zhǔn)入，本文中僅涉及有普遍參考價(jià)值的非同位素的高胰島素正糖鉗夾技術(shù)。

1.1.1 原理

實(shí)驗(yàn)中持續(xù)穩(wěn)定輸注外源性人胰島素達(dá)到抑制內(nèi)源性胰島素分泌的目的，通過動(dòng)態(tài)調(diào)整葡萄糖溶液的輸注速率使血糖穩(wěn)定在目標(biāo)范圍內(nèi)，依據(jù)穩(wěn)態(tài)期葡萄糖輸注速率的高低判斷小鼠整體對(duì)外源性胰島素的敏感性，即相同外源性胰島素輸注率、達(dá)到同樣的血糖目標(biāo)，葡萄糖輸注率越高胰島素敏感性越好。

1.1.2 注意事項(xiàng)

常用人胰島素作為外源性胰島素進(jìn)行輸注，輸注的速率依據(jù)具體研究目的而設(shè)定，且受到諸多因素的影響，包括內(nèi)源生糖情況、實(shí)驗(yàn)對(duì)象的胰島素抵抗程度以及重點(diǎn)評(píng)估代謝器官組織的種類等。研究表明，外源性胰島素以0.8mU/kg/min速率輸注不能抑制肝臟的葡萄糖輸出，而2.5、4、20mU/kg/min的劑量能夠充分抑制肝糖輸出[2]。此外可設(shè)置預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，如通過腹腔注射的胰島素耐量實(shí)驗(yàn)初步了解胰島素敏感性情況。因此，如研究關(guān)注肝臟胰島素敏感性，可選用0.8～2.5mU/kg/min作為胰島素輸注劑量，而胰島素輸注率>2.5mU/kg/min主要用于觀察外周組織的胰島素敏感性。鉗夾穩(wěn)態(tài)期目標(biāo)血糖值常設(shè)定在空腹基礎(chǔ)血糖水平。

1.2 小鼠高糖鉗夾

高糖鉗夾是評(píng)估胰島分泌功能的金標(biāo)準(zhǔn)，其他簡(jiǎn)易評(píng)估方法包括口服葡萄糖耐量、靜脈葡萄糖耐量、HOMA-β指數(shù)等。

1.2.1 原理

通過持續(xù)輸注固定濃度的葡萄糖溶液、調(diào)整葡萄糖輸注速度使血糖穩(wěn)定在目標(biāo)高值，每5～10 min采血測(cè)定胰島素及C肽釋放水平，用于評(píng)估胰島素的一相和二相分泌能力。輔以彈丸式注射胰高血糖素或精氨酸[3]可進(jìn)一步評(píng)估最大胰島分泌功能。

1.2.2 注意事項(xiàng)

葡萄糖起始輸注速度以及目標(biāo)血糖濃度的確定可能會(huì)因模型而異。起始可參照文獻(xiàn)[4]中類似模型進(jìn)行，如使用20%的葡萄糖溶液持續(xù)輸注，目標(biāo)血糖為20mmol/L左右。

1.3 小鼠高胰島素低糖鉗夾

高胰島素低糖鉗夾是評(píng)估機(jī)體對(duì)抗低糖的反應(yīng)能力以及下丘腦–垂體–腎上腺功能的金標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.1 原理

生理學(xué)研究標(biāo)明，當(dāng)血糖低于穩(wěn)態(tài)范圍會(huì)誘發(fā)機(jī)體一系列對(duì)抗血糖降低的機(jī)制，相應(yīng)情況因血糖降低程度、下降速度以及機(jī)體基礎(chǔ)狀態(tài)而異。多項(xiàng)研究表明[5～7]，血糖降低至正常范圍低限附近時(shí)，胰島素的分泌受到顯著抑制，而當(dāng)血糖進(jìn)一步下降至3.9mmol/L以下時(shí)，一系列升糖激素分泌顯著增多，包括胰高血糖素、腎上腺素、生長(zhǎng)激素、皮質(zhì)醇等，而當(dāng)血糖進(jìn)一步降低至3.0mmol/L以下時(shí)，可能影響認(rèn)知功能障礙。因此，基于上述低血糖生理反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，在高胰島素低糖鉗夾中通過輸注16～ 20 mIU/kg/min外源性人胰島素降低血糖水平，同時(shí)通過調(diào)整50%葡萄糖溶液輸注率使血糖控制在2.5～3.5 mmol/L范圍內(nèi)，目標(biāo)血糖可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩{(diào)整，同時(shí)在不同時(shí)間點(diǎn)采血檢測(cè)升糖激素水平或評(píng)估小鼠神經(jīng)認(rèn)知功能。例如研究胰高血糖素的分泌與調(diào)控，在2.5mmol/L顯著低血糖水平以及3.5 mmol/L輕度低血糖水平均能檢測(cè)到內(nèi)源性胰高血糖素的分泌，而在3.5～4.0 mmol/L可檢測(cè)到穩(wěn)態(tài)期胰高血糖素的閾值[8]。2015年瑞典Ahrén教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了梯度高胰島素低糖鉗夾實(shí)驗(yàn)方案，即目標(biāo)血糖設(shè)置在2.5、3.5、4.5、6.0mmol/L等不同階梯水平，用于評(píng)估不同血糖下胰高血糖素的分泌情況[8]。

1.3.2 注意事項(xiàng)

考慮到清醒狀態(tài)下小鼠可能會(huì)發(fā)生應(yīng)激，導(dǎo)致血糖波動(dòng)，有研究團(tuán)隊(duì)采用麻醉狀態(tài)下的高胰島素低糖鉗夾[8,9]，但是也有學(xué)者認(rèn)為，麻醉劑可能會(huì)影響到機(jī)體對(duì)低血糖的響應(yīng)?？傮w而言，目前業(yè)界認(rèn)為清醒狀態(tài)下的小鼠高胰島素低糖鉗夾是理想的評(píng)估機(jī)體對(duì)抗低血糖反應(yīng)的模型。

2 儀器與材料

2.1 手術(shù)器械及耗材

體視顯微鏡(圖1A)、眼科剪、眼科鑷、顯微剪、顯微鑷、動(dòng)脈夾、6-0絲線。

2.2 鉗夾器械

HARVARD微量注射泵，購(gòu)自于美國(guó)Harvard Bioscience公司(圖1, A和B)；RWD小動(dòng)物麻醉機(jī)，購(gòu)自于深圳市瑞沃德生命科技有限公司(圖1B)。

2.3 管路耗材

硅膠管，內(nèi)部直徑0.3mm (Fisher Scientific, #11-189-14)；硅膠管，內(nèi)部直徑0.5 mm (Fisher Scientific，#11-189-15A)；硅膠管，內(nèi)部直徑1.47mm (Fisher Scientific，#11-189-15E)；

PE管，內(nèi)部直徑0.28mm，PE-10 (Fisher Scientific, #14-170-12P)；PE管，內(nèi)部直徑0.38mm，PE-20 (Fisher Scientific, #14-170-12A)。

2.4 其他試劑耗材

0.9%無菌生理鹽水、肝素鈉注射液、戊巴比妥鈉、異氟烷、重組人胰島素注射液(優(yōu)泌林R)、葡萄糖注射液、脫毛膏、青霉素、無菌棉球、血糖儀、離心機(jī)、電熱毯、BD無菌注射器等。

3 手術(shù)方法

為了建立雙通路系統(tǒng)，分別對(duì)小鼠頸總動(dòng)脈及頸靜脈進(jìn)行置管，實(shí)現(xiàn)動(dòng)脈側(cè)采血、靜脈側(cè)輸液，從而滿足不同鉗夾實(shí)驗(yàn)設(shè)定的要求。其中，麻醉狀態(tài)鉗夾可于手術(shù)后開展，清醒狀態(tài)鉗夾需要將雙側(cè)腹側(cè)面置管經(jīng)皮下隧道至頸背部的Mouse Antenna for Sampling Access (MASA)裝置固定，同時(shí)縫合頸部切口，待術(shù)后5～7天小鼠創(chuàng)面愈合、體重回升后進(jìn)行清醒狀態(tài)鉗夾。

動(dòng)靜脈置管法具有采血質(zhì)量高不易溶血、小鼠應(yīng)激少等優(yōu)點(diǎn)，但因手術(shù)復(fù)雜、死亡率高、置管堵管風(fēng)險(xiǎn)高等缺點(diǎn)對(duì)操作者及實(shí)驗(yàn)投入有很高的要求。簡(jiǎn)化版可采取頸靜脈置管輸液、尾靜脈采血，但有研究表明小鼠清醒狀態(tài)下從尾靜脈單次采血100 μL以上明顯增加小鼠體內(nèi)兒茶酚胺物質(zhì)含量[2]。

圖1 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科小鼠葡萄糖鉗夾平臺(tái)設(shè)置及操作實(shí)況

A：手術(shù)用體式顯微鏡、Harvard微量注射泵、離心機(jī)等儀器設(shè)備；B：RWD小動(dòng)物麻醉機(jī)；C：動(dòng)靜脈置管術(shù)中，體視顯微鏡及顯微鑷；D：充分游離的頸動(dòng)脈；E：術(shù)后恢復(fù)正常進(jìn)食中的小鼠；F：小鼠清醒狀態(tài)鉗夾頸背部用于采血輸液的MASA裝置；G：小鼠清醒狀態(tài)鉗夾實(shí)驗(yàn)中。

3.1 術(shù)前準(zhǔn)備

3.1.1 導(dǎo)管制備及其他準(zhǔn)備工作

將手術(shù)器械或耗材進(jìn)行高溫高壓消毒，保證手術(shù)環(huán)境無菌。

準(zhǔn)備合適長(zhǎng)度、數(shù)目的耗材，并充分肝素化。

靜脈導(dǎo)管：取長(zhǎng)6cm內(nèi)徑0.3mm硅膠管，在距離前端1.2cm處套一段長(zhǎng)0.2cm的內(nèi)徑0.5mm硅膠管，前端修剪為帶50°～75°坡度的尖端，75%乙醇浸泡30 min以上，200U/mL肝素鈉充滿、不銹鋼針芯封閉備用。

動(dòng)脈導(dǎo)管：取長(zhǎng)5cm內(nèi)徑0.5 mm硅膠管，前端插入長(zhǎng)1.2cm PE-10導(dǎo)管，修剪尖端，75%乙醇浸泡30 min以上，200U/mL肝素鈉充滿、不銹鋼針芯封閉備用。

3.1.2 麻醉

8～20周適齡小鼠，年齡過小過大或其他發(fā)育異常情況可能增加手術(shù)及鉗夾過程失敗風(fēng)險(xiǎn)。使用60 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射或異氟烷吸入麻醉小鼠，必要時(shí)術(shù)中輔以鎮(zhèn)痛藥物。

3.1.3 脫毛消毒

將小鼠固定于體式顯微鏡下，四肢膠布固定，頭后仰位，暴露頸部置管術(shù)區(qū)，提前規(guī)劃手術(shù)創(chuàng)口，使用脫毛膏對(duì)周圍范圍進(jìn)行脫毛處理，使用碘伏對(duì)術(shù)區(qū)進(jìn)行消毒并使用酒精脫碘。

3.1.4 人員準(zhǔn)備

術(shù)者進(jìn)行手衛(wèi)生、穿干凈工作服、戴無菌手套進(jìn)入無菌區(qū)域操作。

3.2 手術(shù)流程

3.2.1 手術(shù)切口

小鼠仰臥位頭對(duì)術(shù)者，頸部充分暴露，根據(jù)術(shù)者習(xí)慣選取動(dòng)脈置管側(cè)及靜脈置管側(cè)，以下描述選取小鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈置入動(dòng)脈插管、右側(cè)頸靜脈作為靜脈插管(圖1C)。

動(dòng)脈置管切口：取頸部正中偏左側(cè)3 mm行一長(zhǎng)約5～6mm與縱軸平行切口。

靜脈置管切口：取可見淺表頸靜脈分支處行一長(zhǎng)約4～5mm切口。

3.2.2 分離血管

為了充分暴露，避免損傷周圍解剖結(jié)構(gòu)(尤其是伴行神經(jīng))，要逐層分離血管周圍結(jié)構(gòu)，使用無齒顯微鑷游離血管約1～1.5 cm，保證足夠的操作置管區(qū)域。

頸總動(dòng)脈的分離：剪開皮膚后掀開頜下腺，從氣管旁間隙向左下頸部肌群肌腱背側(cè)尋見頸總動(dòng)脈血管鞘，鈍頭無齒顯微血管鉗鈍性分離血脈及周圍結(jié)構(gòu)，尤其避免牽拉伴行的迷走神經(jīng)，避免扯斷小動(dòng)脈分支(圖1D)。

頸靜脈的分離：靜脈血管壁薄彈性弱，輕輕分離其與周圍結(jié)締組織，避免對(duì)血管的直接劃壓，容易形成假腔甚至撕裂。

3.2.3 結(jié)扎、穿刺、置管

頸總動(dòng)脈置管：選取小鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈(圖2)，在游離段下放置用于結(jié)扎絲線，頭端結(jié)扎，近心端打活結(jié)，動(dòng)脈夾在游離段的近心端夾閉血流，左手使用顯微鑷輔助提起游離段，注意不扭曲翻轉(zhuǎn)血管，并保持合適的張力，使用顯微剪在中段稍偏頭側(cè)剪一不超過周徑2/3的口子，順勢(shì)將準(zhǔn)備好的動(dòng)脈插管置入并向近心端推送，注意避免插管與血管平行避免尖端對(duì)血管壁的損傷，妥善將置管與血管及周圍組織固定，結(jié)扎頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端，松開動(dòng)脈夾后可見搏動(dòng)的血液液面，插入動(dòng)脈導(dǎo)管，再次結(jié)扎頭端與近心端，固定導(dǎo)管，可使用含肝素的生理鹽水少量推注潤(rùn)洗，避免堵管。局部創(chuàng)面注意保濕減少揮發(fā)或縫合。

頸靜脈置管：選取小鼠右側(cè)頸靜脈(圖2)，結(jié)扎、穿刺、置管基本同上述操作，無需準(zhǔn)備動(dòng)脈夾，尤其注意靜脈血管壁薄扁平易塌陷，減少置管的試探次數(shù)，置管時(shí)保證深度，降低固定時(shí)滑脫可能。妥善固定、潤(rùn)洗管道后注意局部創(chuàng)面注意保濕減少揮發(fā)或縫合。

圖2 小鼠動(dòng)靜脈置管及葡萄糖鉗夾配置示意圖

示意圖在www.BioRender.com網(wǎng)站繪制導(dǎo)出。

3.2.4 固定裝置配置

此步驟僅適用于清醒狀態(tài)小鼠鉗夾實(shí)驗(yàn)，將置入并固定的動(dòng)靜脈置管在腹側(cè)頸部預(yù)留一定長(zhǎng)度、其余經(jīng)皮下隧道匯集至背側(cè)頸部與MASA裝置相連，梳理導(dǎo)管使得動(dòng)脈導(dǎo)管在左側(cè)、靜脈導(dǎo)管在右側(cè)。固定于不易被小鼠碰觸破壞的頸項(xiàng)部，保證用含肝素生理鹽水充分潤(rùn)洗，避免堵管。后續(xù)鉗夾經(jīng)由與MASA裝置相連而完成輸液及采樣(圖1F)。

3.3 術(shù)后注意事項(xiàng)

3.3.1 術(shù)后狀態(tài)檢查

用于麻醉狀態(tài)鉗夾的小鼠，置管術(shù)后檢查通過后即可開展鉗夾實(shí)驗(yàn)，置管狀態(tài)關(guān)系到實(shí)驗(yàn)過程是否順利、結(jié)果是否穩(wěn)定可靠。

手術(shù)切口：局部是否滲血，如有需要及時(shí)結(jié)扎或壓迫止血；局部創(chuàng)面覆蓋蘸有生理鹽水的棉球，可降低創(chuàng)面蒸發(fā)引起的失水。循環(huán)容量的顯著丟失將直接影響鉗夾實(shí)驗(yàn)，必要時(shí)需考慮回輸異體小鼠全血。

管路情況：檢查置管是否固定妥當(dāng)，管路內(nèi)充分肝素化，對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行至關(guān)重要。

麻醉狀態(tài)：如有條件，建議使用氣體麻醉方式維持鉗夾實(shí)驗(yàn)過程中的麻醉深度，蘇醒、疼痛、掙扎等均會(huì)影響小鼠狀態(tài)從而影響整體結(jié)果。此外，麻醉狀態(tài)過深對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷也有影響。

對(duì)于清醒狀態(tài)鉗夾，整個(gè)術(shù)后狀態(tài)的檢查延續(xù)至正式鉗夾實(shí)驗(yàn)前，通常1周左右。

3.3.2 保溫與麻醉復(fù)蘇

術(shù)后注意使用加熱墊對(duì)小鼠所在籠盒進(jìn)行保溫，腹部朝下，注意避免小鼠過熱，墊料中可酌情加入棉球、碎紙等保溫材料，小鼠可自如活動(dòng)后及時(shí)將籠盒從加熱墊上取下。

如預(yù)計(jì)小鼠麻醉復(fù)蘇時(shí)間較長(zhǎng)，需定期巡視查看小鼠呼吸心率是否正常、手術(shù)區(qū)域是否有滲血。

如判斷短期內(nèi)無法正常獲得常規(guī)飼料槽內(nèi)固體飼料的，可在墊料上放置少量軟食保證攝入。同時(shí)仔細(xì)檢查水瓶防止意外出現(xiàn)滲漏致使小鼠失溫?fù)p失。

3.3.3 小鼠狀態(tài)檢查

關(guān)注小鼠攝食進(jìn)水情況、監(jiān)測(cè)體重變化是評(píng)估小鼠狀態(tài)直接、簡(jiǎn)便的辦法。每日評(píng)估內(nèi)容包括：

體重監(jiān)測(cè)：術(shù)后體重下降是正?，F(xiàn)象，常在術(shù)后第3天達(dá)到低谷，術(shù)后5～7天能基本恢復(fù)到術(shù)前體重；

感染征象：檢查手術(shù)切口局部的愈合情況，是否有紅腫、滲出、化膿等跡象；

疼痛征象：有無蜷縮、毛發(fā)零亂等情況，必要時(shí)考慮輔助鎮(zhèn)痛藥物，同時(shí)密切評(píng)估有無感染；

窒息征象：因手術(shù)操作涉及頸部，如損傷周圍神經(jīng)或局部滲出壓迫，可影響小鼠呼吸而致命；

卒中征象：因動(dòng)脈置管結(jié)扎了一次頸動(dòng)脈，如對(duì)側(cè)供血不能完全代償，可出現(xiàn)腦卒中表現(xiàn)，如提起鼠尾小鼠轉(zhuǎn)圈、活動(dòng)遲緩、爬行姿勢(shì)異常或明顯單側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)受限等，應(yīng)盡早確認(rèn)后棄用。

3.3.4 置管的檢查與維護(hù)

管路的檢查與維護(hù)對(duì)于最后實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行至關(guān)重要，主要檢查是否妥善固定在位、是否通暢、是否完整。

動(dòng)靜脈置管及MASA裝置的固定：動(dòng)靜脈置管局部通過縫合線固定于血管及周圍組織，避免局部滲血、滲液及置管脫落，尤其是實(shí)驗(yàn)中反復(fù)采血對(duì)動(dòng)脈置管有牽拉可能，如固定松動(dòng)增加置管滑出風(fēng)險(xiǎn)。MASA裝置通過生物粘合劑粘在小鼠頸背部，是實(shí)驗(yàn)過程中重要的輸液及采樣樞紐，因外露于小鼠體外，需注意小鼠異常搔抓破壞、啃食等可能。

管路通暢性檢查：為了保證置管通暢性，需定期使用肝素生理鹽水沖刷管路，測(cè)試采血和輸液能否正常進(jìn)行，保證管道中不積存血液增加堵管風(fēng)險(xiǎn)。

管路完整性檢查：實(shí)驗(yàn)中MASA后外露管道需進(jìn)一步延長(zhǎng)與儀器相連，如存在損傷滲漏，會(huì)導(dǎo)致鉗夾實(shí)驗(yàn)無法正常開展。密切檢查關(guān)注，及時(shí)處理干預(yù)，對(duì)于保證管路完整性至關(guān)重要。可稍增加MASA后外露管道長(zhǎng)度，便于如發(fā)生管道損傷滲漏，可通過截去損傷部位而繼續(xù)開展實(shí)驗(yàn)，但預(yù)留的管路不宜過長(zhǎng)，否則增加小鼠啃食、玩耍、破壞的可能。

4 操作流程及應(yīng)急方案

4.1 操作流程

不同類型的鉗夾流程類似，下述以高胰島素正糖鉗夾為例(圖1G，圖2)。

(1)小鼠提前5h禁食不禁飲，如為玉米芯墊料需同樣棄去，更換為刨花墊料。

(2)葡萄糖溶液及胰島素稀釋液：選用20%葡萄糖溶液；為避免胰島素吸附于注射器及管路管壁，添加3%小鼠血漿或BSA用于結(jié)合穩(wěn)定胰島素，提高胰島素濃度的均一性。

(3)無論是麻醉狀態(tài)或清醒狀態(tài)，確認(rèn)管路完整后將微量泵輸液端與靜脈導(dǎo)管連接，如有回血及時(shí)用含50U/mL肝素的無菌生理鹽水沖洗，避免堵管，將連接1mL注射器的延長(zhǎng)管與動(dòng)脈導(dǎo)管連接，使用試管架保證注射器尖端朝下，并預(yù)充如有回血及時(shí)用含50U/mL肝素的無菌生理鹽水。動(dòng)脈導(dǎo)管端為采血端，每次抽取200 μL液體進(jìn)入注射器，使得管路中預(yù)充的肝素被完全抽取至注射器中，從而保證采樣端小鼠血液未被肝素稀釋，采樣結(jié)束后連接回輸注射器中的血液，并保證管路肝素化。

(4)實(shí)驗(yàn)開始前留取約50 μL全血用于分離血清測(cè)定胰島素水平，同時(shí)血糖儀測(cè)定基礎(chǔ)血糖，此時(shí)記錄為0min，即刻開始輸注胰島素與葡萄糖溶液。

(5)每5min在動(dòng)脈導(dǎo)管端測(cè)定血糖一次，根據(jù)血糖水平調(diào)整微量泵設(shè)定的葡萄糖輸注率，使得血糖達(dá)到目標(biāo)值范圍，一般為4.5～5.5mmol/L或?qū)?yīng)的空腹血糖水平。因外源性胰島素的輸注，在實(shí)驗(yàn)開始階段葡萄糖輸注率有一明顯的爬升，又受到全身胰島素敏感性的影響，堅(jiān)持適量調(diào)整盡早達(dá)到穩(wěn)態(tài)的原則，一般整個(gè)高胰島素正糖鉗夾進(jìn)行120min，在80min左右達(dá)到穩(wěn)態(tài)期，保證最后平臺(tái)期穩(wěn)定時(shí)間在30min以上，一般在90min和120min分別留取50 μL全血進(jìn)行血清胰島素的測(cè)定。

(6)使用實(shí)驗(yàn)最后30min即90～120min的平均葡萄糖輸注率作為評(píng)估胰島素敏感性的重要指標(biāo)。

4.2 應(yīng)急方案

4.2.1 堵管

發(fā)生堵管時(shí)首先檢查小鼠狀態(tài)，其次檢查管路狀態(tài)，是否存在擠壓打折或液體輸注故障。對(duì)于靜脈管路，可嘗試在不脫落的前提下適當(dāng)回退，再次嘗試輸液是否通暢，有時(shí)可能由于導(dǎo)管頭端貼緊血管壁而發(fā)生輸液不長(zhǎng)，回退可能有助于再次輸液。對(duì)于動(dòng)脈管路，觀察管路中是否存在隨心搏的血液界面起伏，檢驗(yàn)是否因?yàn)樽⑸淦鲀?nèi)部堵塞，如為后者及時(shí)更換。如判斷靜脈和動(dòng)脈管路存在栓塞可能，小心使用含肝素溶液進(jìn)行小幅度沖洗，一部分情況可恢復(fù)正常輸液或采血。對(duì)于清醒狀態(tài)鉗夾術(shù)后管路維護(hù)，推薦使用50U/mL肝素溶液沖管，并以80%丙三醇+300U/mL肝素溶液封管，對(duì)于預(yù)防堵管(尤其動(dòng)脈導(dǎo)管)有明顯改善。

4.2.2 滲血脫管失血

尤其是清醒狀態(tài)下的鉗夾，如因小鼠過度活動(dòng)導(dǎo)致局部滲血、導(dǎo)管脫落、甚至小鼠明顯失血的，第一時(shí)間找到事故點(diǎn)進(jìn)行止血修復(fù)，嘗試是否能夠重新連接管路恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，若存在明顯失血但小鼠尚可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的，可嘗試輸注小鼠異體紅細(xì)胞血液糾正失血狀態(tài)。若預(yù)計(jì)小鼠無法耐受后續(xù)實(shí)驗(yàn)的，盡早根據(jù)動(dòng)物福利規(guī)定終止實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行安樂死。

4.2.3 麻醉狀態(tài)過程中蘇醒

置管過程中熟練的手術(shù)操作對(duì)于增加成功率尤為重要，如小鼠有蘇醒征象可酌情進(jìn)行補(bǔ)給麻醉藥品。異氟烷吸入麻醉有誘導(dǎo)時(shí)間短、蘇醒快的特點(diǎn)，推薦使用，且用量可實(shí)時(shí)控制。戊巴比妥鈉及異氟烷對(duì)血糖無明顯影響。

5 結(jié)語

糖代謝研究中尤其重視胰島素敏感性或胰島功能的精準(zhǔn)評(píng)估，高胰島素正糖鉗夾、高糖鉗夾和低糖鉗夾分別作為評(píng)估胰島素敏感性、胰島功能及低血糖反饋的金標(biāo)準(zhǔn)。與此同時(shí)，小鼠作為重要的模式動(dòng)物，在小鼠中構(gòu)建上述鉗夾技術(shù)平臺(tái)對(duì)于推動(dòng)相關(guān)代謝基礎(chǔ)研究、促成高質(zhì)量研究成果具有重要意義。然而，這些技術(shù)平臺(tái)的建立對(duì)于人員技術(shù)水準(zhǔn)、儀器設(shè)備支撐具有相當(dāng)高的要求。因此，簡(jiǎn)述方法建立過程、梳理操作流程、對(duì)重點(diǎn)細(xì)節(jié)內(nèi)容進(jìn)行要點(diǎn)提示具有重要意義。本文總結(jié)了小鼠葡萄糖鉗夾方法的建立與操作，為其他團(tuán)隊(duì)移植或更新小鼠葡萄糖鉗夾方法提供了參考。本文首先歸納總結(jié)了三類常用小鼠葡萄糖鉗夾技術(shù)，從核心技術(shù)原理出發(fā)延伸到具體應(yīng)用，羅列了平臺(tái)建設(shè)所需儀器設(shè)備及耗材，隨后重點(diǎn)闡述了小鼠動(dòng)靜脈置管的手術(shù)方法以及鉗夾操作規(guī)程。為了提升實(shí)驗(yàn)指南的可讀性和可操作性，特別增加了注意事項(xiàng)要點(diǎn)和應(yīng)急方案處置。

綜上所述，本文就小鼠葡萄糖鉗夾尤其是清醒狀態(tài)鉗夾技術(shù)的建立與操作提供了詳細(xì)的操作流程與注意事項(xiàng)，為小鼠實(shí)驗(yàn)研究中胰島素敏感性及胰島功能的精準(zhǔn)評(píng)估提供了一種可操作方案。

感謝美國(guó)Vanderbilt-NIDDK小鼠代謝表型中心在小鼠鉗夾技能培訓(xùn)方面給予的技術(shù)和理論指導(dǎo)。感謝北京軍事醫(yī)學(xué)院科學(xué)院王莉莉教授團(tuán)隊(duì)在小鼠頸動(dòng)脈置管技術(shù)方面的指導(dǎo)。

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Establishment and operation of glucose clamp technique in mice

Yingyun Gong, Zhenzhen Fu, Hongwen Zhou

Glucose metabolism plays a central role in energy supply and metabolism regulation in various tissues and organs. Besides, insulin is the sole hormone lowering blood glucose in the body, and islet function and insulin sensitivity are the key steps modulating glucose metabolism. Since the development of glucose clamp technology, it has been recognized as the gold standard for evaluating insulin metabolism. The main categories include hyperinsulinemia-euglycemia clamp, hyperglycemia clamp, and hyperinsulinemia-hypoglycemia clamp. These can be done on either anesthetized mice or conscious and unrestricted mice. This protocol focuses on the establishment and operation of the mouse glucose clamp technique, including preparation of instrument consumables, surgical operations, clamping procedures, and precautions, serving as reference and guidance.

hyperinsulinemia-euglycemia clamp; hyperglycemia clamp; hyperinsulinemia-hypoglycemia clamp; insulin sensitivity; beta-cell function

2022-07-26;

2022-08-16;

2022-10-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31900832，82170882)，江蘇省科技廳基礎(chǔ)研究計(jì)劃(編號(hào)：BK20191074)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31900832, 82170882), the Basic Research Project of Jiangsu Science and Technology Office (No. BK20191074)

龔穎蕓，博士，主治醫(yī)師，研究方向：肝臟的糖脂代謝調(diào)控。E-mail: gongyingyun@njmu.edu.cn

付真真，博士，主治醫(yī)師，研究方向：肥胖與胰島素敏感性。E-mail: zhenzhen1127@foxmail.com

龔穎蕓和付真真并列第一作者。

周紅文，博士，主任醫(yī)師/教授，研究方向：肥胖及糖脂代謝疾病。E-mail: drhongwenzhou@njmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-252

(責(zé)任編委: 陳帥)