CUT&Tag技術(shù)在代謝組織細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)操作

張子寅，周燕萍，孟卓賢

實(shí)驗(yàn)操作指南

CUT&Tag技術(shù)在代謝組織細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)操作

張子寅1,2，周燕萍1,2，孟卓賢1,2

1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，杭州 310058 2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院浙江省疾病蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058

染色體靶向切割和標(biāo)簽化(clevage under target and tagment, CUT&Tag)技術(shù)利用Tn5轉(zhuǎn)座酶與Protein A/G的融合蛋白，引導(dǎo)Tn5酶至與靶蛋白結(jié)合的抗體附近，對(duì)靶蛋白結(jié)合的附近染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行切割，隨后通過標(biāo)簽化處理對(duì)片段化染色質(zhì)進(jìn)行文庫(kù)制備，并利用高通量測(cè)序技術(shù)獲取特定位點(diǎn)或蛋白質(zhì)結(jié)合位置的染色質(zhì)信息。CUT&Tag技術(shù)在蛋白質(zhì)和DNA相互作用的研究領(lǐng)域起到了重大作用，不僅可以了解組蛋白修飾發(fā)生的位置，而且可以明確轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的區(qū)域。相較于傳統(tǒng)的染色質(zhì)免疫沉淀高通量測(cè)序(chromatin immunoprecipitation- sequencing, ChIP-seq)技術(shù)，CUT&Tag技術(shù)具有信噪比高、可重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)周期短、細(xì)胞投入量低等優(yōu)點(diǎn)，在早期胚胎發(fā)育、干細(xì)胞、腫瘤以及表觀遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域體現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。本文將針對(duì)CUT&Tag在代謝組織細(xì)胞(以小鼠原代胰島細(xì)胞為例)的具體操作步驟進(jìn)行描述，以提供一種研究代謝細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)方法。

CUT&Tag；組蛋白修飾；操作步驟；代謝組織細(xì)胞

蛋白質(zhì)與DNA的相互作用是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵，也是啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的前提。能夠與DNA互作的蛋白質(zhì)主要包括組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、DNA甲基化酶和染色質(zhì)重塑復(fù)合物等。為了研究蛋白質(zhì)-DNA互作，科學(xué)家發(fā)明了很多方法：凝膠阻滯、DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)、甲基化干擾、體內(nèi)足跡、酵母雜交、ChIP- seq等。其中ChIP-seq可以真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的靶蛋白，是一種研究蛋白質(zhì)-DNA互作的傳統(tǒng)且經(jīng)典的方法[1]。但該技術(shù)需要投入大量細(xì)胞、步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、得到的數(shù)據(jù)背景較高且需要的測(cè)序量大、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，這些缺點(diǎn)限制了其在低起始細(xì)胞量實(shí)驗(yàn)上的應(yīng)用。因此，研究者在不斷尋找新的替代方法。CUT&Tag是近年興起的一種新型蛋白質(zhì)–DNA相互作用研究方法[2]，該方法利用Protein A/G能和抗體相互作用的原理，通過融合的Protein A/G-Tn5轉(zhuǎn)座子，將轉(zhuǎn)座體富集在靶抗體周圍的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)特異性的片段化反應(yīng)。相較于傳統(tǒng)的ChIP-seq，CUT&Tag操作相對(duì)簡(jiǎn)單、無需甲醛交聯(lián)、信噪比較高、所需測(cè)序量少，且適用于極低起始量和單細(xì)胞的應(yīng)用場(chǎng)景[3]。CUT&Tag的主要流程包括：(1)ConA beads和細(xì)胞結(jié)合；(2)表面活性劑digitonin透化細(xì)胞，并進(jìn)行一抗和二抗孵育；(3)洗去多余的抗體，通過ProteinA/ G-Tn5轉(zhuǎn)座體使其結(jié)合在靶位點(diǎn)附近；(4)洗去多余的轉(zhuǎn)座體，通過鎂離子的活化轉(zhuǎn)座體作用，在37℃的條件下進(jìn)行片段化反應(yīng)；(5)加入SDS終止反應(yīng)，乙醇沉淀DNA片段；(6)進(jìn)行PCR建庫(kù)以及二代測(cè)序獲取文庫(kù)信息[4]。本文將以小鼠原代胰島細(xì)胞為例，針對(duì)CUT&Tag在代謝組織細(xì)胞的具體操作步驟進(jìn)行描述。

1 儀器與材料

實(shí)驗(yàn)所需的儀器、試劑和耗材詳見表1。

2 試劑配制

2.1 結(jié)合試劑(Binding buffer)

取200 μL 1 mol/L pH 7.9 HEPES、100 μL 1 mol/L KCl、10 μL 1 mol/L CaCl2、10 μL 1 mol/L MnCl2，使用雙蒸水定容至10 mL配制成Binding buffer。Binding buffer可在4℃保存6個(gè)月。

2.2 洗滌試劑(Wash buffer)

取1mL 1 mol/L pH 7.5 HEPES、1.5 mL 5 mol/L NaCl、12.5 μL 2 mol/L Spermidine、500 μL Protease inhibitor(100×)，使用雙蒸水定容至50 mL配制成Wash buffer。Wash buffer試劑可在4℃保存1周。

2.3 毛地黃皂苷洗滌試劑(Dig-wash buffer)

取40 mL Wash buffer，加入400 μL 5% Digitonin，配制成Dig-wash buffer。Dig-wash buffer可在4℃保存2天。5% Digitonin需使用DMSO配制。

2.4 抗體結(jié)合試劑(Antibody buffer)

取2 mL Dig-wash buffer，加入8 μL 0.5 mol/L EDTA和20 μL 10% BSA，配制成Antibody buffer。Antibody buffer配制完后需置于冰上預(yù)冷，并保證現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.5 毛地黃皂苷-300試劑(Dig-300 buffer)

取1 mL 1 mol/L pH7.5 HEPES、3 mL 5 mol/L NaCl、12.5 μL 2 mol/L Spermidine、100 μL 5% Dig-i-tonin、500 μL Protease inhibitor(100×)，使用雙蒸水定容至50 mL配制成Dig-300 buffer。未添加5% Digitonin的Dig-300 buffer可于4℃放置1周，Digitonin應(yīng)在使用當(dāng)天加入，以減少沉淀的生成。

表1 CUT&Tag實(shí)驗(yàn)所需的儀器、試劑及耗材信息

2.6 片段化試劑(Tagmentation buffer)

取5 mL Dig-300 buffer，加入50 μL 1 mol/L MgCl2配制成Tagmentation buffer。Tagmentation buffer需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

3 細(xì)胞獲取及ConA beads處理

3.1 ConA beads預(yù)處理(以一個(gè)樣品為例，如有多個(gè)樣品可按倍數(shù)增加試劑用量)

3.1.1 取出10 μL混勻的ConA beads至1.5 mL EP管中。

3.1.2 加入100 μL Binding Buffer(按照體積比Binding Buffer：ConA beads=10∶1)，輕輕吹打混勻ConA beads(請(qǐng)勿振蕩混勻)。

3.1.3 將EP管置于磁力架上，靜置2 min左右，待溶液澄清后棄盡上清。

3.1.4 重復(fù)步驟3.1.2、3.1.3一次。

3.1.5 加入10 μL Binding Buffer重懸ConA beads。

注意：

實(shí)驗(yàn)操作過程中避免劇烈的震蕩，破壞磁珠完整性。

3.2 小鼠原代胰島細(xì)胞的準(zhǔn)備

3.2.1 收取大約200個(gè)正常大小的小鼠胰島至新的1.5 mL EP管中，短暫離心(<100 ×)5 s，棄上清。

3.2.2 取2 mL TrypLE Express Enzyme至15 mL管中，轉(zhuǎn)移所有胰島至該15 mL管中。

3.2.3 于37℃水浴鍋中消化10 min，每隔1 min輕彈幾下15 mL管，使胰島完全重懸，每隔5 min，用1 mL移液槍緩慢吹打胰島8～10下，第一次吹打需使胰島完全解體至肉眼不可見。

3.2..4 加入4 mL 含2 mmol/L EDTA，0.5% BSA的PBS緩沖液以終止消化，將細(xì)胞于600 ×，室溫離心5 min，棄掉上清。

3.2.5 室溫條件下加入1 mL Wash Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞于600 ×室溫離心5 min，棄盡上清。

3.2.6 重復(fù)步驟3.2.5一次。

3.2.7 視所得細(xì)胞量加入0.5～1 mL Wash Buffer重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞活力染色，計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞活力，保證細(xì)胞活力在80%以上。

3.2.8 取適量細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)適用的細(xì)胞投入量為60～ 100000個(gè)/樣品)于新的1.5 mL EP管中，使用Wash Buffer定容至100 μL。

注意：

1) 細(xì)胞活力對(duì)于實(shí)驗(yàn)成功與否至關(guān)重要，一定要保證細(xì)胞的活力在80%以上，最好在90%以上。

2) 在進(jìn)行細(xì)胞染色、計(jì)數(shù)等涉及到吸取細(xì)胞的過程前，需要混勻細(xì)胞，以確保細(xì)胞吸取數(shù)量的準(zhǔn)確性。

3) 在細(xì)胞通透之前的所有步驟都在室溫下進(jìn)行，使細(xì)胞受到的刺激最小化。

4 CUT&Tag文庫(kù)構(gòu)建操作

4.1 ConA beads與細(xì)胞結(jié)合

4.1.1 低速振蕩含有細(xì)胞的EP管，同時(shí)加入10 μL混勻的ConA beads懸液，室溫下置于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)孵育10 min。

4.1.2 短暫離心(<100 ×)收集反應(yīng)液于管底，將EP管置于磁力架上，靜置2 min左右，待溶液澄清后棄盡上清。

注意：

1) 使用ConA beads前應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算beads富集效率。

2) ConA beads和細(xì)胞結(jié)合后的所有步驟應(yīng)避免開蓋時(shí)間過長(zhǎng)，否則會(huì)出現(xiàn)暴露于空氣導(dǎo)致beads干燥從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.2 孵育一抗

4.2.1 按照一定比例(1:50)配制含有目的一抗的Antibody buffer，置于冰上。

4.2.2 在ConA beads與細(xì)胞結(jié)合復(fù)合物中加入50 μL預(yù)冷的 Antibody Buffer，輕輕吹打混勻，置于冰上。

4.2.3 置于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)室溫孵育2 h或4℃孵育過夜。

注意：

1) 四維旋轉(zhuǎn)混合儀轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，請(qǐng)確保液體一直保持在管的底部和側(cè)面，中途可輕彈管底混勻，緩解磁珠干結(jié)。

2) 每一次實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置陽性對(duì)照抗體(如H3Ace、H3K4me3)和陰性對(duì)照抗體(如Normal Rabbit IgG)

4.3 孵育二抗

4.3.1 短暫離心(<100 ×)收集反應(yīng)液于管底，將EP管置于磁力架上，靜置2 min左右，待溶液澄清后棄盡上清。

4.3.2 按照一定比例(1∶100)配制含有目的二抗的Dig-wash Buffer。

4.3.3 在ConA beads與細(xì)胞結(jié)合復(fù)合物中加入100 μL Dig-wash Buffer，輕輕吹打混勻。

4.3.4 置于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)室溫孵育1 h。

4.3.5 短暫離心(<100 ×)收集反應(yīng)液于管底，將EP管置于磁力架上，靜置2 min左右，待溶液澄清后棄盡上清。

4.3.6 加入1 mL Dig-wash Buffer，輕輕吹打混勻。

4.3.7 重復(fù)步驟4.3.5、4.3.6兩次。

注意：

四維旋轉(zhuǎn)混合儀轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，請(qǐng)確保液體一直保持在管的底部和側(cè)面，中途可輕彈管底混勻，緩解磁珠干結(jié)。

4.4 pA/pG-Tn5 Transposase孵育

4.4.1 短暫離心(<100 ×)收集反應(yīng)液于管底，將EP管置于磁力架上，靜置2 min左右，待溶液澄清后棄盡上清。

4.4.2 按照1∶100的比例配制含有Hyperactive pG/pA-Tn5 Transposase的Dig-300 Buffer(終濃度為0.04 μmol/L)。

4.4.3 在ConA beads與細(xì)胞結(jié)合復(fù)合物中加入100 μL pG/pA-Tn5-Dig-300 Buffer混合液，輕輕吹打混勻。

4.4.4 置于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)室溫孵育1 h。

4.4.5 短暫離心(<100 ×)收集反應(yīng)液于管底，將EP管置于磁力架上，靜置2 min左右，待溶液澄清后棄盡上清。

4.4.6 加入1 mL Dig-300 Buffer，輕輕吹打混勻。

4.4.7 重復(fù)步驟4.4.5、4.4.6兩次。

注意：

1) 四維旋轉(zhuǎn)混合儀轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，請(qǐng)確保液體一直保持在管的底部和側(cè)面，中途可輕彈管底混勻，緩解磁珠干結(jié)。

2) NaCl濃度的增加會(huì)減緩Hyperactive pG /pA-Tn5 Transposase與染色質(zhì)可開放區(qū)域的結(jié)合。

3) Dig-300 Buffer加入后有可能會(huì)出現(xiàn)白色沉淀，不影響孵育和清洗。

4.5 激活轉(zhuǎn)座子，進(jìn)行DNA片段化

4.5.1 短暫離心(<100 ×)收集反應(yīng)液于管底，將EP管置于磁力架上，靜置2 min左右，待溶液澄清后棄盡上清。

4.5.2 加入 300 μL Tagmentation Buffer，輕輕吹打混勻。

4.5.3 37℃孵育1 h，期間可輕彈混勻2～3次。

4.6 DNA提取

4.6.1 室溫下，每個(gè)反應(yīng)中加入10 μL 0.5 mol/L EDTA，3 μL 10% SDS和2.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，劇烈震蕩混勻，終止片段化反應(yīng)。

4.6.2 短暫離心收集液體于管底，50℃孵育1 h(或者37℃孵育過夜)。

4.6.3 加入300 μL DNA抽提試劑(PCI，苯酚：氯仿：異戊醇=25∶24∶1，注意不要取到上層水相)，上下劇烈搖晃10次，然后高速震蕩2 s。

4.6.4 16000 ×，室溫離心5 min。

4.6.5 小心吸取上層水相(約250 μL)至新的1.5 mL EP管中，加入300 μL氯仿，上下顛倒10次(請(qǐng)勿振蕩)，16000 ×室溫離心5 min。

4.6.6 小心吸取上層水相(約180 μL)至新的1.5 mL EP管中，加入750 μL無水乙醇，上下顛倒10次，置于冰上。

4.6.7 冰上冷卻后，標(biāo)記好離心方向，4℃，16000 ×離心15 min。

4.6.8 小心棄盡液體，并倒扣在紙巾上將液體瀝干。

4.6.9 加入1 mL預(yù)冷的無水乙醇漂洗，4℃，16000 ×離心5 min。

4.6.10 小心地倒出液體并在紙巾上瀝干后，在空氣中倒扣晾干。

4.6.11 待管干燥后，加入30 μL 1 × TE(10 mmol/L Tris-HCl[pH 8.0], 1 mmol/L EDTA, RNsseA)。

4.6.12 37℃孵育10 min。

4.6.13 直接進(jìn)行后續(xù)步驟或置于-80 °C儲(chǔ)存。

注意：

無水乙醇沉淀DNA時(shí)往往沉淀物不可見，此時(shí)應(yīng)小心棄盡上清，避免將沉淀物倒出。

4.7 文庫(kù)擴(kuò)增

4.7.1 在PCR管中按如下體系配制50 μL PCR反應(yīng)體系：30 μL片段化的DNA、7μL雙蒸水、10 μL 5×TAB、1 μL 20 μmol/L N5 index引物、1 μL 20 μmol/L N7 index引物、1 μL TAE。

注意：

CUT&Tag建庫(kù)過程使用雙端index引物，因此需在PCR體系中同時(shí)添加N5和N7 index引物，后續(xù)測(cè)序策略選擇雙端測(cè)序。

4.7.2 輕輕吹打混勻PCR體系，在PCR儀中進(jìn)行如下反應(yīng)：72℃ 3 min→98℃ 30 s→(98℃ 15 s、60℃30 s、72℃ 30 s)12～15個(gè)循環(huán)→72℃ 5 min→4℃保存。

注意：

1) 可根據(jù)實(shí)際情況或參考文獻(xiàn)選擇合適的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

2) 文庫(kù)產(chǎn)量與細(xì)胞類型、細(xì)胞投入量、靶蛋白的豐度及PCR的循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物存在一定關(guān)系，實(shí)驗(yàn)時(shí)不宜追求過高的文庫(kù)產(chǎn)量而設(shè)置過高的PCR循環(huán)數(shù)，防止因高PCR循環(huán)數(shù)引起過度擴(kuò)增，使文庫(kù)DNA片段呈現(xiàn)大片段分布。

4.8 文庫(kù)純化

4.8.1 提前20 min將VAHTS DNA Clean Beads置于室溫平衡，隨后震蕩使其充分混勻，加60 μL VAHTSDNA Clean Beads 到上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物中，吹打混勻10次以上保證整個(gè)體系均勻。

4.8.2 室溫孵育5 min。

4.8.3 將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體。

4.8.4 保持PCR管在磁力架上，待溶液澄清(約5 min)，棄去上清，注意不要擾動(dòng)到磁珠。

4.8.5 保持PCR管在磁力架上，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇，加入乙醇時(shí)不要擾動(dòng)磁珠，孵育30 s后小心移除上清。

4.8.6 重復(fù)步驟4.8.5一次。

4.8.7 開蓋干燥3～5 min。

4.8.8 磁珠晾干后，將PCR管從磁力架上取出，加入22 μL 雙蒸水覆蓋磁珠，吹打混勻磁珠。

4.8.9 室溫孵育5 min(如果磁珠干燥開裂，適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間)。

4.8.10 將PCR管短暫離心收集置于磁力架中分離磁珠和液體，直到溶液澄清(約5 min)。

4.8.11 小心吸取20 μL上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中。

注意：

不同地區(qū)環(huán)境干濕程度有差別，磁珠晾干時(shí)間不一，磁珠剛好晾干，表面無光澤即可。過度干燥會(huì)導(dǎo)致洗脫困難，未完全晾干會(huì)有酒精殘留影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)。該純化步驟也可以使用其他文獻(xiàn)報(bào)道的純化方式[5]。

5 文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)

5.1 2%瓊脂糖凝膠電泳初步判斷文庫(kù)質(zhì)量

一般而言，H3K4Me3的CUT&Tag文庫(kù)在凝膠電泳圖中呈現(xiàn)150～1000 bp的彌散樣條帶，而IgG的文庫(kù)則無明顯條帶(圖1)。

5.2 Qubit檢測(cè)文庫(kù)濃度

使用Qubit定量技術(shù)，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行濃度檢測(cè)。一般而言，組蛋白修飾的文庫(kù)所得DNA濃度偏高，而轉(zhuǎn)錄因子或其他靶蛋白所得文庫(kù)濃度會(huì)較低。檢測(cè)得到的文庫(kù)濃度只能反映是否含有DNA及其濃度，無法作為文庫(kù)構(gòu)建成功的最終指標(biāo)，需要經(jīng)過下一步的文庫(kù)片段分布檢測(cè)才可判斷文庫(kù)是否構(gòu)建成功，也可以不進(jìn)行濃度檢測(cè)，直接進(jìn)行文庫(kù)片段分布檢測(cè)。

圖1 使用瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)小鼠原代胰島細(xì)胞的CUT&Tag文庫(kù)質(zhì)量

5.3 文庫(kù)片段分布檢測(cè)

使用Agilent 2100 Bioanalyzer或等效產(chǎn)品，進(jìn)行文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)。一般而言，H3K4Me3的CUT&Tag文庫(kù)峰型圖呈現(xiàn)核小體倍數(shù)大小的階梯狀，而IgG的文庫(kù)峰應(yīng)普遍很低(圖2)。

注意：

實(shí)驗(yàn)中研究的靶蛋白不同，文庫(kù)峰型存在一定差異。研究組蛋白修飾的文庫(kù)峰型圖呈現(xiàn)核小體倍數(shù)大小的階梯狀；轉(zhuǎn)錄因子存在靶蛋白特異性，無固定峰型，在180～1000 bp之間有片段分布便可進(jìn)行測(cè)序。

6 小鼠胰島細(xì)胞CUT&Tag測(cè)序、分析流程及典型結(jié)果

6.1 上機(jī)策略

樣品送至安諾優(yōu)達(dá)(北京)公司，使用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150。

6.2 分析流程

上游分析步驟參考弗雷德-哈欽森癌癥研究中心疫苗和傳染病部Ye Zheng提供的分析流程(https://yezhengstat.github.io/CUTTag_tutorial/)，做完peaks在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site, TSS)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(transcription end site, TES)附近的可視化富集分析后，可以得到如下代表熱圖結(jié)果(圖3)。同時(shí)使用IGV將校準(zhǔn)后的bigwig文件可視化，可以得到H3K4Me3和IgG的peaks在小鼠基因附近分布的結(jié)果(圖4)。

圖2 使用LabChip Touch檢測(cè)小鼠原代胰島細(xì)胞的CUT&Tag文庫(kù)質(zhì)量

7 結(jié)語

由于傳統(tǒng)的ChIP-seq實(shí)驗(yàn)需要的高細(xì)胞投入量，導(dǎo)致在胰島領(lǐng)域研究蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子)-DNA互作是一項(xiàng)極其困難的工作：為了拿到一個(gè)好的ChIP- seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往需要投入上百只實(shí)驗(yàn)小鼠的胰島細(xì)胞[6]。而CUT&Tag這種新興的蛋白質(zhì)-DNA互作研究方法的問世，則可以解決傳統(tǒng)ChIP-seq方法所需要的高細(xì)胞投入量、產(chǎn)生結(jié)果的低重復(fù)性、低信噪比等問題。自問世以來，CUT&Tag已經(jīng)被應(yīng)用在多種細(xì)胞的研究中，但在小鼠原代胰島細(xì)胞中仍未被證實(shí)適用。本文描述了針對(duì)小鼠原代胰島細(xì)胞CUT&Tag的具體操作步驟，并利用本實(shí)驗(yàn)室已成功測(cè)序的案例，提供了一種研究胰島細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)方法，證明了CUT&Tag在胰島細(xì)胞中的可行性。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室以往的研究也表明CUT&Tag不僅可以檢測(cè)胰島細(xì)胞中組蛋白-DNA的互作，也可以用于研究胰島轉(zhuǎn)錄因子-DNA之間的互作[7,8]。

圖3 小鼠胰島細(xì)胞H3K4Me3和IgG的CUT&Tag peaks在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(TES)周圍富集的熱圖

圖4 小鼠胰島細(xì)胞H3K4Me3和IgG的CUT&Tag peaks在Slc2a2基因周圍的分布

圖5 小鼠胰島細(xì)胞的CTCF CUT&Tag peaks在H3K4Me1、H3K4Me3 ChIP-seq數(shù)據(jù)中距離TSS-3到+3 kb區(qū)域的富集情況

Kaya-Okur等[2]在2019年最早介紹CUT&Tag技術(shù)的時(shí)，便比較了ChIP-seq和CUT&Tag在測(cè)序結(jié)果上的差異：當(dāng)二者采用相同測(cè)序深度(8×106reads)時(shí)，CUT&Tag測(cè)到的組蛋白修飾基因位點(diǎn)約為ChIP-seq的20倍，同時(shí)CUT&Tag擁有比ChIP-seq更高的信噪比、更好的重復(fù)性。并且，Henikoff團(tuán)隊(duì)通過CTCF 的CUT&Tag表明了其對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)也更加靈敏[2]。在本文中，小鼠胰島細(xì)胞H3K4Me3的CUT&Tag所讀取到的peaks有大約1/2分布在啟動(dòng)子區(qū)域，這和組蛋白H3K4Me3會(huì)和啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的特性一致，說明了該方法在小鼠胰島CUT&Tag測(cè)序上的準(zhǔn)確性。而且，本實(shí)驗(yàn)室之前的研究中也發(fā)現(xiàn)小鼠胰島CTCF的CUT&Tag結(jié)合位點(diǎn)在啟動(dòng)子和增強(qiáng)子均有很強(qiáng)的結(jié)合(H3K4Me1和H3K4Me3 ChIP-seq數(shù)據(jù)來源于SRA數(shù)據(jù)庫(kù)：SRP000660)(圖5)。

綜上所述，本文為實(shí)現(xiàn)小鼠原代胰島細(xì)胞CUT&Tag提供了詳細(xì)的操作步驟和結(jié)果，為研究胰島細(xì)胞的蛋白質(zhì)-DNA互作以及表觀遺傳學(xué)提供了一種可推廣的方法。

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The protocol of CUT&Tag for metabolic tissue cells

Ziyin Zhang1,2, Yanping Zhou1,2, Zhuo-Xian Meng1,2

Cleavage under target and tagment (CUT&Tag) is a technology that utilizes the fusion protein of Tn5 transposase and protein A/G which can guide Tn5 enzyme to the antibody bound to target protein and cleave the chromatin regions adjacent to target protein. Chromatin libraries are then tagged and sequenced by the high-throughput sequencing to obtain chromatin information at specific sites or protein binding locations. CUT&Tag technology plays an important role in the research of DNA and protein interactions. It can be used to understand the modifications of histone and the bindings of transcription factors. Compared with the traditional chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) technology, the CUT&Tag has the strengths of high signal-to-noise ratio, good repeatability, short experimental period, and low cell input. It shows great advantages in early embryonic development, stem cells, cancer, epigenetics and other research fields. In this article, we described the protocol of CUT&Tag for metabolic tissue cells (mouse primary islet cells), to provide an epigenetic method for studying metabolic cells.

CUT&Tag; histone modification; protocol; metabolic cell

2022-08-01;

2022-09-20;

2022-10-03

國(guó)家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃(編號(hào)：91857110)，國(guó)家重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃(編號(hào)：2018YFA0800403、2016YFC1305303)，國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81670740)，國(guó)家優(yōu)秀青年科學(xué)基金(編號(hào)：81722012)，浙江省自然科學(xué)基金(編號(hào)：LZ21H070001)，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究院、中央高校基本科研專項(xiàng)基金、杭州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)基金(編號(hào)：OO20200055)、王寬誠(chéng)教育基金資助 [Supported by the Training Program of the Major Research Plan of the National Natural Science Foundation of China (No. 91857110), the National Key Research and Development Program of China (Nos. 2018YFA0800403, 2016YFC1305303), the National Natural Science Foundation of China (No. 81670740), the National Natural Science Fund for Excellent Young Scholars of China (No. 81722012), the Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (No. LZ21H070001), the Innovative Institute of Basic Medical Sciences of Zhejiang University, and the Fundamental Research Funds for the Central Universities, the Construction Fund of Medical Key Disciplines of Hangzhou (No. OO20200055), and K.C. Wong Education Foundation]

張子寅，碩士研究生，專業(yè)方向：病理與病理生理學(xué)。E-mail: ziyinzhang@zju.edu.cn

孟卓賢，博士，教授，研究方向：病理與病理生理學(xué)。E-mail: zxmeng@zju.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-253

(責(zé)任編委: 周紅文)