水和食品中衛(wèi)生細(xì)菌的快速檢驗(yàn)研究進(jìn)展

王婷

（北流市疾病預(yù)防控制中心，廣西 北流，537400）

當(dāng)下，由于飲用水及食品中的致病菌污染引發(fā)的傳染病及食物中毒等不良事件時(shí)常發(fā)生。因此需對(duì)水果、蔬菜、肉類(lèi)等食物定期實(shí)施細(xì)菌的檢測(cè)，以對(duì)細(xì)菌污染的狀況進(jìn)行了解。若僅采用單純的常規(guī)檢驗(yàn)方式，則檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)，無(wú)法在較短的時(shí)間內(nèi)快速得出鑒定結(jié)果。因此，多種快速檢驗(yàn)方式應(yīng)運(yùn)而生。只有采用快速檢驗(yàn)方式對(duì)大量的食物樣品及飲用水實(shí)施檢驗(yàn)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題并實(shí)施干預(yù)措施才能有效避免各種腸道傳染病及食物中毒等不良事件的發(fā)生。本文對(duì)飲用水及食物中衛(wèi)生細(xì)菌的快速檢驗(yàn)進(jìn)展綜述如下。

1 分子生物學(xué)檢驗(yàn)方式

聚合酶鏈反應(yīng)是近年來(lái)應(yīng)用于檢驗(yàn)及研究不同致病微生物的新型技術(shù)。目前對(duì)于該種檢驗(yàn)方式的研究也在不斷的深入，如派生出定量、多重及免疫PCR 等。但PCR 技術(shù)檢驗(yàn)細(xì)菌的原理是采用細(xì)菌中各菌種的核酸序列，從而設(shè)計(jì)出相關(guān)引物，對(duì)細(xì)菌核酸實(shí)施擴(kuò)增，使用核酸檢測(cè)儀及凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行觀察。

1.1 多重PCR丁衛(wèi)平[1]等對(duì)食品中的單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的hlyA 及iap 實(shí)施多重PCR，分別擴(kuò)增出131-bp 及234-bp片段。汪斌[2]等利用大腸桿菌所特有的eaeA 基因設(shè)計(jì)的多重引物，同時(shí)擴(kuò)增出DNA 及1087bp 序列。多重PCR 檢驗(yàn)方式具有較高的準(zhǔn)確度、特異度及靈敏度，且能快速得出檢驗(yàn)結(jié)果。

1.2 免疫-PCR楊艷[3]等先采用免疫磁性顆粒對(duì)肉類(lèi)中沙門(mén)氏菌實(shí)施分離，后再對(duì)其應(yīng)用PCR 予以檢驗(yàn)。所使用的的免疫磁性顆粒上包被羊抗鼠lgG 的抗體并再與單克隆抗體相連。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，取1ml 經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的增菌液，后加入免疫磁性顆粒5ul，并持續(xù)搖晃10min，后在磁場(chǎng)的作用下使磁顆粒逐漸向磁極積聚，去除上清液。采用無(wú)菌生理鹽水對(duì)磁顆粒實(shí)施清洗。磁顆粒重懸于20ul 水中，加熱至90℃，5min 以使細(xì)菌裂解，使用離心法將磁顆粒進(jìn)行去除，將上清液用于PCR 檢驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，使用緩沖蛋白胨水增菌培養(yǎng)24h 最低檢驗(yàn)限為1g 肌肉染有0.1CFU 的沙門(mén)氏菌。

1.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性一般微生物遺傳物質(zhì)均有較高的特異度，但時(shí)常種屬相似的微生物間有同源序列，使按照某一種細(xì)菌DNA 片段設(shè)計(jì)出的引物，時(shí)常對(duì)其他細(xì)菌也可擴(kuò)增出一樣的產(chǎn)物，使檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象。此時(shí)應(yīng)用隨機(jī)引物可將兩種致病菌經(jīng)采用PCR 擴(kuò)增出不同的DNA 圖譜，按照不同圖譜的特征對(duì)致病菌進(jìn)行區(qū)分。相關(guān)研究學(xué)者曾使用不同致病菌，經(jīng)PCR 檢驗(yàn)大腸桿菌O157：H7eaeA 基因的引物的特異性，發(fā)現(xiàn)豬霍亂沙門(mén)氏菌也可擴(kuò)增出一樣的產(chǎn)物[4]。由經(jīng)采用1 條S571隨機(jī)引物對(duì)兩個(gè)致病菌實(shí)施PCR 檢驗(yàn)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，兩種致病菌DNA 圖譜存在明顯不同，進(jìn)而可準(zhǔn)確的將其區(qū)分。

1.4 采用PCR 研究致病菌致病機(jī)理陳建林[5]等采用PCR 檢驗(yàn)對(duì)副溶血性弧菌的耐熱直接溶血素及耐熱、直接溶血素的因素實(shí)施檢驗(yàn)，其認(rèn)為判定弧菌致病機(jī)理的依據(jù)為耐熱溶血素。副溶血性弧菌存在耐熱溶血素即可致病，神奈川陰性僅在體外條件下未充分表達(dá)[6]。應(yīng)用生物學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定不僅有較高的準(zhǔn)確性，其能對(duì)細(xì)菌的致病機(jī)理從分子水平上實(shí)施進(jìn)一步研究。

2 免疫學(xué)檢驗(yàn)方式

免疫學(xué)檢驗(yàn)檢驗(yàn)儀器相對(duì)價(jià)廉，操作過(guò)程簡(jiǎn)便，實(shí)用性較好，在衛(wèi)生檢驗(yàn)方面的應(yīng)用得到認(rèn)可。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法潘子強(qiáng)[7]等分別應(yīng)用單克隆及多克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附法檢驗(yàn)大腸桿菌 O157：H7，其不僅能應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，同時(shí)能應(yīng)用于水及食物細(xì)菌檢驗(yàn)中。酶聯(lián)免疫吸附法操作簡(jiǎn)單、快速，且具有較高的準(zhǔn)確性及特異性，是對(duì)大量樣品實(shí)施診斷的理想檢驗(yàn)方式。

2.2 免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是一種新型的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，霍亂主要經(jīng)糞-口途徑傳播。李倩茹[8]等以膠體金技術(shù)作為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出一種檢驗(yàn)霍亂弧菌的試劑盒。在檢驗(yàn)過(guò)程中，先使細(xì)菌與單克隆抗體結(jié)合，再使其與多克隆抗體結(jié)合，使得大量的致病菌被捕獲，因細(xì)菌與有鮮紅的膠金顆粒結(jié)合，進(jìn)而可通過(guò)肉眼直接觀察檢驗(yàn)結(jié)果。彭志蘭[9]等采用相似的膜條層析免疫法對(duì)霍亂弧菌實(shí)施檢驗(yàn)，在較短的時(shí)間內(nèi)即可判斷檢驗(yàn)結(jié)果。

2.3 免疫磁性分離技術(shù)張蕾[10]等將沙門(mén)氏菌的免疫磁球與其他培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)合應(yīng)用，對(duì)生禽中的沙門(mén)氏菌實(shí)施分離，免疫磁性分離技術(shù)可顯著提升致病菌的檢出率。蘇濤[11]等該種檢驗(yàn)技術(shù)與比色法測(cè)定PCR 產(chǎn)物相結(jié)合，對(duì)飲用水及食物樣品中的耶爾森氏菌實(shí)施分離及檢驗(yàn)。多種檢驗(yàn)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)的完全自動(dòng)化，可顯著減少檢驗(yàn)人員的工作量，適合在大量樣品檢驗(yàn)中應(yīng)用。

3 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器技術(shù)使用生物體本身作為敏感材料，通過(guò)合適的方式固定于分子識(shí)別元件，在于信號(hào)轉(zhuǎn)換器件組成的傳感器[12]。該種技術(shù)在微生物代謝及細(xì)菌計(jì)數(shù)的生物電極檢驗(yàn)中的應(yīng)用得到認(rèn)可。井良義[13]等采用氧傳感器對(duì)細(xì)菌數(shù)進(jìn)行快速檢驗(yàn)，使其達(dá)到實(shí)用程度。凡是含有過(guò)氧化氫的細(xì)菌均可出現(xiàn)該種反應(yīng)，該種檢驗(yàn)方式最低檢驗(yàn)限為104個(gè)/ml 細(xì)菌。實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需實(shí)施培養(yǎng)，將被檢樣品制成檢液后即可完成檢驗(yàn)，適用于單一致病菌的快速計(jì)數(shù)。

4 顯微染色計(jì)數(shù)法

顯微染色計(jì)數(shù)法是將細(xì)胞進(jìn)行染色，借助顯微鏡計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量的方式。

4.1 丫啶橙染色計(jì)數(shù)法相關(guān)研究學(xué)者曾采用丫啶橙染色法對(duì)細(xì)菌實(shí)施鏡檢，操作步驟為：取水樣本10ml 加入試管中，加入甲醛樣品0.5ml，最后加入丫啶橙溶液2ml，染色3min，后將細(xì)菌過(guò)濾至濾膜上，將1 滴香柏油滴入，將蓋玻片蓋上，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)菌數(shù)[14]。通過(guò)對(duì)視野及濾膜面積進(jìn)行測(cè)量計(jì)算出樣本中所含的細(xì)菌數(shù)量。該種檢驗(yàn)方式可因細(xì)菌在濾膜表面分布不均勻造成樣品體積較小的細(xì)菌數(shù)量出現(xiàn)偏差。

4.2 活菌直接計(jì)數(shù)法活菌直接計(jì)數(shù)法的原理是利用吡哌酸及吡咯酸對(duì)細(xì)菌DNA 的復(fù)制產(chǎn)生抑制，造成其無(wú)法分裂，但不會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)其他合成途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)造成影響，在一定濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存在的情況下，菌體生長(zhǎng)，變大，通過(guò)熒光染色，易計(jì)數(shù)出來(lái)[15]。采用DVC 技術(shù)的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞還存在新的存活方式：活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。在液體中無(wú)法繁殖成一定大小的菌落，并不說(shuō)明其已經(jīng)死亡，有可能是變成活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，僅是在培養(yǎng)環(huán)境下無(wú)法進(jìn)行繁殖[16]。一旦培養(yǎng)條件適宜，病原菌復(fù)蘇后仍具有較強(qiáng)的致病能力。

5 微菌落計(jì)數(shù)法

近年來(lái)有諸多研究學(xué)者對(duì)微菌落計(jì)數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究及應(yīng)用。因其可通過(guò)短時(shí)培養(yǎng)，借助顯微鏡即可觀察檢驗(yàn)結(jié)果，具有較高的準(zhǔn)確性，通過(guò)將其完善，可用于基層對(duì)水及食物中的細(xì)菌實(shí)施快速檢驗(yàn)[17-18]。鄒翔[19]等采用聚碳酸酯濾膜對(duì)水樣品實(shí)施過(guò)濾，并在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)3h，將濾膜上的菌落實(shí)施加熱及固定，并使用復(fù)紅染色實(shí)施漂洗，借助顯微鏡對(duì)菌落進(jìn)行觀察。該種檢驗(yàn)方式重復(fù)性好，且與瓊脂傾注平板法相比，檢測(cè)大腸菌群，檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差異。

不同的快速檢驗(yàn)方式均具有不同的優(yōu)勢(shì)及缺陷。整體來(lái)看，快速檢驗(yàn)方式在衛(wèi)生檢驗(yàn)方面的應(yīng)用得到認(rèn)可，有望成為對(duì)水及食物中細(xì)菌快速檢驗(yàn)的方式，微菌落及顯微染色計(jì)數(shù)法最可能實(shí)現(xiàn)，其能快速的檢驗(yàn)出被檢樣品中衛(wèi)生狀況。