外泌體來源microRNAs在心肌肥大中的研究進展

徐慧秋，吳 霏，李振漢，陸 薇，徐崇俊，黃玉瑾，沈 哲，劉繼純，陳 浩

(皖南醫(yī)學(xué)院1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.藥學(xué)院；3.公共衛(wèi)生學(xué)院；4.弋磯山醫(yī)院心內(nèi)科；5.病理解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241000)

外泌體能夠攜帶核酸、蛋白質(zhì)以及miRNA等在細胞間遞送，從而實現(xiàn)細胞間信息交流。心肌肥大的產(chǎn)生和發(fā)展過程涉及復(fù)雜的生物機制，包括多種信號傳導(dǎo)通路，且各種信號途徑之間交錯聯(lián)系，關(guān)系極為錯綜復(fù)雜。外泌體參與腫瘤、心血管疾病等的病理過程，是多種疾病的生物標(biāo)志物，也是這些疾病治療的潛在靶點。本文主要聚焦于外泌體在心肌肥大產(chǎn)生發(fā)展過程中的作用最新研究進展。

1 外泌體基本特征與作用機制

外泌體具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，是由多囊體(multivesicular body,MVBs)與細胞膜融合分泌而來，直徑40～100 nm[1]。MVBs通過內(nèi)吞作用使得胞內(nèi)聚集著細胞質(zhì)中的各種生物活性物質(zhì)，然后MVBs與質(zhì)膜的融合，這些物質(zhì)釋放到細胞外環(huán)境，形成外泌體。外泌體通過包裹著的信號分子、RNA和miRNA參與旁分泌和自分泌過程[2]。脂質(zhì)雙分子膜上的配體可以靶向受體細胞，成為藥物靶向載體的基礎(chǔ)[3]。由于其低毒性、良好的穩(wěn)定性和生物相容性，是藥物和基因治療的理想載體[4]。研究表明，這些膜結(jié)合蛋白使外泌體能夠特異性到達特定組織或微環(huán)境。有時配體過大，膜蛋白的整合可能會干擾蛋白在表面的正確折疊和表達。因此，研究人員試圖利用基因工程富集跨膜蛋白，如Lamp2b[5]。近年來，在心肌缺血部位，通過噬菌體技術(shù)發(fā)現(xiàn)了肽序列CSTSMLKAC。它與外泌體膜上的跨膜蛋白Lamp2b形成重組蛋白，靶向心肌組織。急性缺血、再灌注和慢性缺血模型中使用來自干細胞或全血的外泌體的研究表明，外泌體可以對心臟損傷起到保護作用[6]。

2 miRNA

近年來，非編碼RNA在心肌肥厚中的作用得到了廣泛的研究。非編碼RNA由細胞轉(zhuǎn)錄而來，調(diào)節(jié)多種生物進程。其中通過影響心肌乙?；^程，心肌肥厚可以得到控制[7]。miRNAs是內(nèi)源性小分子非編碼RNA，由17～24個核苷酸參與組成，主要通過互補結(jié)合靶mRNA 的3’UTR從而在靶基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中發(fā)揮作用。miRNA具有生物多樣性，有多種調(diào)控信息的情況。外泌體通過內(nèi)吞途徑向受體細胞釋放脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、miRNA、siRNA和lncRNA，從而觸發(fā)受體細胞的微環(huán)境。這幾年來，細胞微環(huán)境方面研究較之以往更為深入，外泌體有著可以實現(xiàn)細胞間信號傳遞的能力，在成為生物信息載體上具有頗有潛力，由此受到了關(guān)注。外泌體miRNAs在血液、唾液、尿液等體液中均能檢測到，且含量和結(jié)構(gòu)在患者與正常人體液中都有所不同，因此外泌體miRNA可成為特定疾病的生物標(biāo)記物。不同細胞來源的外泌體作為治療心室重構(gòu)的一種新方法，可以打破缺血微環(huán)境對干細胞治療效果的干擾和限制，具有很大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景[8]。

3 不同來源外泌體對心肌肥大的作用

3.1 糖尿病心肌細胞糖尿病性心肌病是糖尿病患者特有的心肌疾病易引發(fā)心功能異常，進而發(fā)展心源性休克，嚴重可致死。糖尿病心肌細胞可以釋放有害的外泌體，其中的熱休克蛋白20(heat-shock protein 20,Hsp20)含量低于正常值。研究表明，Hsp20的過表達可顯著減輕鏈脲佐菌素引起的心功能障礙、肥厚、凋亡、纖維化和微血管稀疏。近期研究顯示，2型糖尿病大鼠心肌細胞釋放的外泌體能夠通過Hsp20表達的負調(diào)控因子miR-320的轉(zhuǎn)移抑制心肌內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管的形成。而伴侶蛋白Hsp20可以通過將細胞保護蛋白自身轉(zhuǎn)移到外泌體中，從而教育心肌細胞中的外泌體[9]。并且這些外泌體蛋白可以被運送到心臟內(nèi)的鄰近細胞，導(dǎo)致氧化應(yīng)激降低，心肌纖維化和凋亡減少，以及心肌血管生成增加。從而使糖尿病引起的心肌病得到緩解。這些結(jié)果表明，外泌體可以通過Hsp20的過表達而重新編程，從而在心肌細胞中起到保護作用。因此，通過Hsp20介導(dǎo)的心肌細胞外泌體有訓(xùn)練治療糖尿病心肌病的潛力。

3.2 肥大性心肌細胞肥大性心肌細胞(hypertrophic cardiomyocytes,HCs)可由血管緊張素II(Angiotensin II,Ang II)誘發(fā)，干擾巨噬細胞中的炎癥信號通路，而炎癥性免疫微環(huán)境情況在心臟肥大的發(fā)展中有極大的影響。HCs衍生的外泌體通過miR-155誘導(dǎo)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun N-終端激酶(c-jun n-terminal kinase,JNK)和p38的磷酸化。在巨噬細胞中過度表達miR-155促進了白細胞介素-6和白細胞介素-8的生產(chǎn)，反映了miR-155在巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥啟動中的重要性。大量研究證明，miR-155還是已知的炎癥調(diào)節(jié)因子。從HC培養(yǎng)基中分離出來的外泌體可以觸發(fā)炎癥細胞因子的分泌[10]。我們進一步發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)AGO2，可以阻止由HC衍生的外泌體誘導(dǎo)的炎癥細胞因子的釋放。這些結(jié)果表明，心肌細胞來源的外泌體將非編碼RNA信息包裝到巨噬細胞中，并通過調(diào)節(jié)基因表達參與受體細胞中的炎癥過程。此前有報道稱miR-155參與了MAPK信號通路的調(diào)節(jié)并在炎癥反應(yīng)的調(diào)控過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。即來自肥厚心肌細胞的外泌體能夠激活miR-155介導(dǎo)的MAPK通路，最終誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥，這在診斷和治療心肌肥厚的有效性方面提供改進方向[11]。

3.3 心肌球源性細胞心肌球源性細胞(cardiac bulbous cells,CDCs)已在人體試驗用于心肌梗死、杜氏肌營養(yǎng)不良和其他適應(yīng)癥。這些細胞通過其抗凋亡、抗纖維化、抗重塑、血管生成和心臟增生性的特性來改善組織修復(fù)。它們還通過分泌外泌體參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)進而保護心臟。高血壓會引起心血管疾病和腎功能不全。由CDCs分泌的外泌體及其中含量最高的小RNA成分，Y RNA片段EV-YF1可以在心肌梗死后起到治療作用。Cambier等發(fā)現(xiàn)注入CDC-exo或EV-YF1可在血壓幾乎無變化的情況下緩解由于Ang II增加導(dǎo)致的心肌肥厚和腎損傷。含有EV-YF1的外泌體或?qū)⒊蔀楦哐獕合嚓P(guān)心血管和腎臟疾病引起的心肌肥大的新的治療思路[12]。

3.4 人誘導(dǎo)多能干細胞分化的心肌細胞多能干細胞(pluripotent stem cell,PSC)是現(xiàn)今干細胞研究方面的熱點。它可以分化成任意的體內(nèi)細胞，進而形成身體的各種組織、器官。移植人誘導(dǎo)多能干細胞分化的心肌細胞(hiPSC-derived cardiac cell,hiPSC-CC)誘導(dǎo)旁分泌機制，能促進血管和小動脈的生長，細胞遷移、增殖和存活。而在細胞之間通信，改善心肌肥厚這些作用可以通過hiPSC-CC外泌體來實現(xiàn)。研究表明，經(jīng)過hiPSC-CC外泌體治療后，實驗動物的左心室功能、梗死面積、壁應(yīng)力、心肌肥厚、凋亡和血管生成的情況都有改善[13]。在hiPSC-CC外泌體中合成的15種最豐富的miRNAs可以改善hiPSC-CM Ca2+瞬態(tài)振幅、凋亡抗性和ATP含量，這表明，這些miRNA可能作為心肌保護信號機制的細胞間信使，促進心肌梗死的恢復(fù)。其中hsa-miR-199a-3p的合成模擬物改善了小鼠心肌梗死模型的心功能和壁厚。人類誘導(dǎo)的過表達環(huán)素D2的hiPSC-CC外泌體可使急性心肌梗死的大型動物模型中移植的心肌細胞循環(huán)激活，由于該模型與人類心肌細胞的增殖能力相似，故該方法可能成為心肌肥大治療的有效策略[14]。

3.5 間充質(zhì)干細胞間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種多能干細胞，它具有自我更新和多向分化能力。它分化的方向十分廣泛，因此常在臨床上使用。機械性應(yīng)力會導(dǎo)致心肌肥大。當(dāng)壓力超載時，miR-29a可能是骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體中包含的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)，有助于心臟保護。miR-29家族，一個在成纖維細胞中富集的miRNA家族，被預(yù)測為參與膠原蛋白和其他細胞外基質(zhì)生產(chǎn)的mRNA的抑制劑。有報道稱，在肥厚性心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM)患者中，循環(huán)miR-29a上調(diào)，這是評估肥厚性心肌病的潛在生物標(biāo)志物。體外實驗表明，過表達miR29a-3p可明顯降低內(nèi)皮素誘導(dǎo)H9c2心肌細胞的肥厚反應(yīng)[15]。MSCs來源的外泌體顯著保護心肌免受心肌肥厚，并在壓力超載時保持心臟功能。MSCs來源的外泌體可以防止血管緊張素II刺激的細胞肥大。另一方面，MSCs來源的外泌體促進體外肌成纖維細胞的過早衰老，表明其在心臟重構(gòu)中的抗纖維化作用。MSCs來源的外泌體保護心肌細胞免受病理性肥大[16]。

3.6 成纖維細胞成纖維細胞來自于胚胎時期的間充質(zhì)細胞。心臟成纖維細胞外泌體分泌的增加是Ang Ⅱ誘導(dǎo)病理性心肌肥厚的一種新的旁分泌機制。miRNA-27a是心臟成纖維細胞來源的外泌體中所含的主要miRNA，與心肌細胞中的肥厚基因表達一起參與氧化應(yīng)激。研究中，心力衰竭大鼠左心室非梗死區(qū)miRNA-27a過客鏈(miRNA-27a passenger strand,miRNA-27a*)明顯上調(diào)，并被包裹入外泌體并分泌到循環(huán)中。生物信息學(xué)分析表明，PDZ和PDLIM5是miRNA-27a*的主要靶點之一，在心臟結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用，并可能參與心肌肥厚的發(fā)生過程中。有數(shù)據(jù)表明，伴隨著肥厚基因的上調(diào)，PDLIM5與miRNA-27a的表達一致，均下降。與正常心臟相比，梗死心臟外泌體中miRNA-27a*的豐度更高，并進一步證明培養(yǎng)的心臟成纖維細胞受Ang Ⅱ刺激分泌富含miRNA27a*外泌體，進入細胞外間隙，這抑制了PDLIM5翻譯。導(dǎo)致心肌細胞肥大基因表達。體內(nèi)研究表明，在充血性心力衰竭大鼠中給予miRNA-27a*抑制劑可部分阻斷內(nèi)源性miR-27a*表達，阻止肥厚基因表達，改善心肌收縮力。這些發(fā)現(xiàn)表明，心臟成纖維細胞分泌的富含miRNA27a*的外泌體有潛力作為心臟肥厚的旁分泌信號中介物，成為新的治療策略[17]。

3.7 脂肪干細胞脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是來自于脂肪組織的一種干細胞。具有干細胞的所有特征，對亞健康、早衰等疾病起到緩解作用。心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,I/R)可引起心肌細胞凋亡。Lai等發(fā)現(xiàn)，ADSC分泌的外泌體(exosomes from adipose-derived stem cells,ADSC-exo)可減輕I/R誘導(dǎo)的心肌肥厚[18]。ADSC-exo處理的I/R小鼠心肌細胞中凋亡相關(guān)蛋白p-p53和 PUMA 以及肥大相關(guān)蛋白ETS-1、ANP的表達均顯著降低。據(jù)報道，PUMA 和ETS-1都是miR-221/222的靶基因。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，I/R處理顯著降低了miR-221/222的表達，而ADSC-exo處理增加了miR-221/222的表達。實驗表明，I/R處理顯著促進了miR-221/222敲除小鼠心肌細胞肥大，而ADSC-exo對其影響有抑制作用。由此可知ADSC-exo通過miR-221/miR-222/PUMA/ETS-1途徑預(yù)防I/R誘導(dǎo)的心肌肥大。這對于I/R誘導(dǎo)的心肌肥大的防治有指導(dǎo)意義。

3.8 脂肪細胞當(dāng)脂肪細胞和心肌細胞共培養(yǎng)，F(xiàn)ang等發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)脂肪細胞和心肌細胞以調(diào)節(jié)心臟重塑的途徑具體是脂肪組織中的PPAR+活化導(dǎo)致外泌體表達和釋放miR-200a進入循環(huán)系統(tǒng)[19]。隨后，含有miR-200a的外泌體靶向心肌細胞，其中的miR-200a抑制TSC1的表達，刺激mTOR信號誘發(fā)心臟肥大。故miR-200a拮抗劑治療可以緩解心肌肥大。

3.9 內(nèi)皮細胞內(nèi)皮細胞是人體上皮細胞的一種。近年來研究表明，內(nèi)皮細胞中的miR-126促進血管重構(gòu)，減少纖維化，是抑制心腦血管相關(guān)疾病的重要因素。實驗結(jié)果表明，腦缺血后小鼠的血清和心臟中miR-126表達顯著降低，miR-126靶基因增加，心肌肥大程度增加。敲除內(nèi)皮細胞中miR-126的小鼠腦缺血后心肌肥大程度則顯著增加。并且用未敲除miR-126小鼠分泌的外泌體處理的小鼠與敲除miR-126小鼠分泌的外泌體處理的小鼠相比，顯示出明顯的miR-126表達增加，且心肌肥大程度降低。故內(nèi)皮細胞分泌的含有miR-126的外泌體對于心肌肥大的治療具有新的治療指導(dǎo)意義[20]。

4 展望

現(xiàn)如今外泌體的研究領(lǐng)域主要集中在腫瘤、細胞免疫和干細胞治療等。但隨著研究范圍的擴大，不同來源的外泌體及其攜帶的多種生物活性物質(zhì)可以調(diào)節(jié)不同緣由引起的心肌肥大。外泌體具有特別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和靶向傳送信息功能，在成為心肌肥大的生物標(biāo)記物和藥物載體方面都具有研究價值。