食品檢測用致瀉大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的研究

大腸埃希氏菌是生活在腸道中的微生物，是腸道菌群的一部分。然而，某些大腸埃希氏菌類型可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。致瀉大腸埃希氏菌就是一類重要的食源性病原體，是腸道疾病相關(guān)的食源性疾病的主要原因，可在人類中傳播和引起感染[1]。致瀉大腸埃希氏菌（DiarrheagenicEscherichia coli，DEC）感染可導(dǎo)致腹痛、腹瀉、出血性結(jié)腸炎等一系列疾病，是一個重要的公共衛(wèi)生問題[2]。在我國，新版《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中的致病菌限量》（GB 29921—2021）中增加了致瀉大腸埃希氏菌的致病菌指標(biāo)，并對肉制品和即食果蔬制品規(guī)定了限量要求。因此，其快速準(zhǔn)確的檢測已成為重點關(guān)注的食品安全問題和衛(wèi)生保健相關(guān)感染問題[3]。

DEC根據(jù)其致病性機(jī)制進(jìn)行分類，涉及與宿主細(xì)胞相互作用中不同的毒力基因，值得注意的是，使用傳統(tǒng)的表型方法，如培養(yǎng)或基礎(chǔ)生化測試，很難將致瀉大腸埃希氏菌株與正常的糞便菌群區(qū)分開來[4]。這些年來，多重PCR、實時熒光定量PCR和等溫擴(kuò)增技術(shù)等新型檢測技術(shù)在致瀉大腸埃希氏菌分子分型檢測中發(fā)揮了重要作用[5]。

標(biāo)準(zhǔn)菌株在微生物檢測中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是保證檢驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠的有力武器[6-7]。標(biāo)準(zhǔn)菌株必須具有清晰的基因組信息背景且穩(wěn)定性良好，目前劉娜等[8]已成功研制出產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、腸道侵襲性大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)。在致瀉大腸埃希氏菌的檢測方法中，要求有陰陽性對照，但對標(biāo)準(zhǔn)菌株編號未作要求。本文利用生化鑒定、PCR鑒定評價了6株試驗菌株作為檢測標(biāo)準(zhǔn)中陰陽性對照菌株的可行性，為檢測機(jī)構(gòu)在選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株時提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

5株大腸埃希氏菌采購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，分別為腸道集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）CICC 24186、腸道出血性大腸埃希氏菌（EHEC）CICC 24187、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）CICC 24188、腸道致病性大腸埃希氏菌（EPEC）CICC 24189和產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）CICC 24190；1株大腸埃希氏菌ATCC 25922來源于美國標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

伊紅美蘭瓊脂（EMB）、革蘭氏染色試劑盒、多重PCR檢測試劑盒來源于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；生化鑒定系統(tǒng)來源于法國生物梅里埃公司；6×Loading buffer、DL2000 DNA Maker均來源于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；1×TAE緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠溶液均來源于生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

GR85DA高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BSC-1360 Ⅱ B2生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；A200 PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；JY300E電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；JY02G凝膠快速成像儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌落及顯微形態(tài)觀察

將6株試驗菌株分別接種于MAC、EMB培養(yǎng)基上，置于36 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察其菌落形態(tài)，并利用生物顯微鏡進(jìn)行顯微形態(tài)觀察。

1.3.2 生化鑒定

將菌懸液接種于生化鑒定卡中，對20種生化反應(yīng)進(jìn)行檢測鑒定；接種后置于36 ℃培養(yǎng)24 h，再滴加反應(yīng)試劑，讀取檢測結(jié)果并登錄鑒定系統(tǒng)獲取鑒定結(jié)果。

1.3.3 基因組DNA提取

利用PCR試劑盒提取6株試驗菌株基因組，用接種環(huán)取兩環(huán)菌落，溶于200 μL裂解液中，渦旋混勻，金屬浴99 ℃或沸水浴裂解20 min，冰浴冷卻后12 000×g離心4 min，取上清即為模板。

1.3.4 多重PCR擴(kuò)增

取PCR Buffer 23 μL加入PCR管中，再加入2 μL DNA模板，總反應(yīng)體系25 μL。預(yù)變性95 ℃，5 min；變性 95 ℃，30 s，復(fù)性 63 ℃，30 s，延伸 72 ℃，1.5 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.5 致瀉性大腸埃希氏菌毒力基因檢測

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》（GB 4789.6—2016）的方法，將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落及顯微形態(tài)觀察

6株試驗菌株在EMB培養(yǎng)基上為紫黑色、光滑、濕潤、邊緣整齊的圓形菌落；在MAC培養(yǎng)基上菌落呈粉紅色、圓形、表面光滑；6株試驗菌株顯微形態(tài)為短桿狀、革蘭氏陰性菌。

2.2 生化鑒定結(jié)果

將生化反應(yīng)結(jié)果上傳到生化鑒定系統(tǒng)中，鑒定結(jié)果如表1所示。6株試驗菌株鑒定結(jié)果均為大腸埃希氏菌，鑒定概率百分比分別為99.9%、99.9%、99.8%、98.5%、99.8%和99.8%，置信度滿足試驗要求，鑒定結(jié)果可靠。

表1 6株試驗菌株生化鑒定結(jié)果表

2.3 致瀉性大腸埃希氏菌毒力基因檢測結(jié)果

依據(jù)GB 4789.6—2016標(biāo)準(zhǔn)方法，對6株大腸埃希氏菌進(jìn)行特征基因PCR擴(kuò)增，如圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測共擴(kuò)增出17條目標(biāo)條帶，目標(biāo)條帶長度在150～1 500 bp。如表2所示，6株試驗菌株ATCC 25922、CICC 24186、CICC 24187、CICC 24188、CICC 24189和CICC 24190檢測出不同的毒力基因條帶。菌株ATCC 25922只檢出uidA基因條帶，符合非致瀉大腸埃希氏菌特征；CICC 24186檢出uidA、pic、aggR、astA毒力基因，符合EAEC特征；CICC 24187檢出uidA、escV、stx2、stx1毒力基因，未檢出bfpB毒力基因，符合EHEC特征；CICC 24188檢出uidA、invE基因，符合EIEC特征；CICC 24189檢出uidA、bfpB、escV基因條帶，未檢出stx2、stx1條帶，符合EPEC特征；CICC 24190檢出uidA、estlb、estla毒力基因條帶，符合ETEC特征。

圖1 6株試驗菌株毒力基因凝膠電泳檢測結(jié)果圖

表2 6株大腸埃希氏菌毒力基因特征表

3 結(jié)論與討論

本文通過菌落及顯微形態(tài)觀察、生化鑒定、PCR鑒定對6株大腸埃希氏菌進(jìn)行分析，并依據(jù)GB 4789.6—2016標(biāo)準(zhǔn)方法對6株大腸埃希氏菌能否作為標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行可行性分析。結(jié)果表明，6株試驗菌 株 ATCC 25922、CICC 24186、CICC 24187、CICC 24188、CICC 24189和CICC 24190均檢測出特征目標(biāo)毒力基因條帶，6株試驗菌株可以作為致瀉大腸埃希氏菌檢驗的標(biāo)準(zhǔn)菌株，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。食品檢測用致瀉大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的研究可為食品微生物工作提供依據(jù)，為檢測機(jī)構(gòu)在選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株時提供參考。