MNNG溶液聯(lián)合多因素誘導(dǎo)胃癌前病變大鼠模型研究進(jìn)展

陳心怡舒 勁

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),中醫(yī)臨床學(xué)院,蘭州 730030;2.甘肅省中醫(yī)院,脾胃病科, 蘭州 730050)

胃癌前病變(precancerous lesions of gastric cancer,PLGC),是腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)及異型增生(dysplasia,Dys)的病理變化過程,是慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)的常見病理表現(xiàn)。Correa[1]提出基于胃癌的發(fā)生經(jīng)過“正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→癌(腸型)”已被不斷證實(shí),PLGC被認(rèn)為是CAG 發(fā)展至胃癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此,如何建立起更加貼近臨床病癥的動物模型,成為了研究胃癌前病變的重要前提。N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)是集誘變與致癌作用為一體的化學(xué)試劑,它能夠直接作用于DNA,使堿基烷化發(fā)生在DNA鏈上而產(chǎn)生致癌作用[2]。MNNG等化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的大鼠模型因其操作簡單,成本低廉,在胃癌前病變動物模型中被廣泛應(yīng)用[3]。然而其濃度、給藥方式及其他配合因素的選擇目前還存在爭議,結(jié)合PLGC之病理變化具有動態(tài)的特殊性,本文將聯(lián)合多因素綜合闡述基于MNNG溶液作用下的造模研究進(jìn)展。

1 MNNG溶液給藥方式及濃度

MNNG溶液給藥方式有自由飲用與灌胃兩種,具體選擇要根據(jù)大鼠種類、實(shí)驗(yàn)周期、研究方向而定。人類所患的95%胃癌類型為腺癌已被證實(shí),MNNG溶液因?yàn)榧谆潭鹊囊蛩?對腺胃更具有親和力[4-6]。陸鈺婷等[7]提出自由飲用狀態(tài)下大鼠模型病變部位大多發(fā)生在腺胃,故此方式能更接近自然因素。但同時(shí)容易受大鼠本身習(xí)性不同的影響,容易造成攝入量和造模效果上的差異。故可以將自由飲用與灌胃結(jié)合起來使用,灌胃方式可以提高模型的誘變率,減少對大鼠的肝、十二指腸的損害[8]。但是對于大樣本量的研究,無形中增加了因操作因素造成的誤差,比如會引起部分大鼠腸脹氣或食管水腫,所以目前對于兩種給藥方式的選擇還未給出一個標(biāo)準(zhǔn),具體的選擇要根據(jù)大鼠樣本量及實(shí)驗(yàn)周期而調(diào)整。除此之外,MNNG溶液的濃度也需要進(jìn)行控制,濃度低則會延長造模周期,難以達(dá)成預(yù)期效果,濃度過高會對大鼠的肝腎引起毒性反應(yīng),甚至直接引發(fā)胃癌,與造模目的不符。周晶等[9]在胃癌前病變的模型探討中證實(shí),自由飲用的濃度應(yīng)在50～120 μg/mL之間,灌胃濃度普遍較自由飲用濃度高,多數(shù)介于80～250 μg/mL之間。馬林等[10]在慢性萎縮性胃炎的造模文章中指出,MNNG溶液在CAG的大鼠造模中濃度不宜超過120 μg/mL,這對建立胃癌前病變的模型具有參考意義,可適當(dāng)增加濃度以保證效果和預(yù)期攝入量。

2 MNNG溶液4種復(fù)合法

目前學(xué)者們最常用到的PLGC大鼠造模方法為MNNG溶液復(fù)合法[11]。此方法是以用一定濃度的MNNG溶液自由飲用或灌胃的方法為主,飼料選用0.03%鹽酸雷尼替丁飼料,再聯(lián)合0.1%氨水或水楊酸鈉溶液或乙醇,在饑飽失?；蛭锢泶碳さ那闆r下組合使用的多因素聯(lián)合造模方式。下文例舉出4種較為常用的方案,此4種方法都選用了0.03%雷尼替丁飼料,鹽酸雷尼替丁為強(qiáng)效H2受體阻斷劑,能抑制胃酸及胃蛋白酶的分泌,胃內(nèi)低酸環(huán)境能促進(jìn)腸上皮化生的發(fā)生,且口服的方法下生物利用度最高,故作為造模因素使用時(shí),為了持續(xù)發(fā)揮抑制胃酸分泌的作用,常與大鼠飼料充分混合后自由進(jìn)食[12-14]。

2.1 MNNG溶液灌胃+氨水自由飲用

魏玥等[15]以120 μg/mL濃度的MNNG溶液灌胃,配合自由飲用0.1%的氨水溶液,飼料為已被廣泛應(yīng)用的0.03%鹽酸雷尼替丁飼料,20周后造模成功。本方案采用的大鼠為Wistar大鼠,其性格溫順,抵制傳染病能力強(qiáng),自性腫瘤發(fā)生率低,適宜短期灌胃[16]。湯小芳等[17]在PLGC大鼠的造模中也選擇了灌胃的給藥方式,每日給予180 μg/mL的MNNG溶液,于第22周出現(xiàn)腸上皮化生。灌胃法的優(yōu)點(diǎn)是誘變率強(qiáng),不易受個體差異的影響,能保持一定濃度和劑量的攝入量,但容易因?yàn)椴僮魅藛T的失誤而導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)腸脹氣、食管水腫,使得死亡率升高。此方案還聯(lián)合了0.1%氨水的自由飲用,陳璐等[18]在CAG大鼠的研究中也運(yùn)用了此方法,8周后大鼠均出現(xiàn)不同程度的胃炎。氨水可模擬幽門螺桿菌(Hp)作用于胃黏膜產(chǎn)生高氨的毒性損害及感染,造成其持續(xù)胃炎狀態(tài),實(shí)驗(yàn)中一般選用0.05%～0.1%的氨水于禁食日自由飲用[19]。本方法采用了單一的灌胃給藥方式,對MNNG溶液的利用率高,減少一部分因個體差異造成的額外試劑耗費(fèi),與持續(xù)造成胃炎狀態(tài)的氨水聯(lián)合作用,在樣本量小于100只的情況下,此方案縮短造模時(shí)間,配合效果佳。

2.2 MNNG溶液自由飲用聯(lián)合灌胃+饑飽失常

Tong等[20]取用SD大鼠自由飲用170 μg/mL的MNNG溶液配合灌胃1 mL/100 g濃度的MNNG;饑飽失常頻率為進(jìn)食2 d,禁食1 d,連續(xù)10周后成功造模。本方案采取了對MNNG溶液自由飲用加灌胃的方式,自由飲用的優(yōu)點(diǎn)是最貼近于病因,可展現(xiàn)真實(shí)的個體差異,且操作便捷,陳澤慧[21]在實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn),由于MNNG溶液不易溶于水,故自由飲用時(shí)藥物有殘留現(xiàn)象,容易導(dǎo)致大鼠攝入量不足,影響造模效果。操作者應(yīng)調(diào)整換水周期,控制在18～24 h之間,并在配置時(shí)用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?4℃保存[22]。本方案為了減小因個體差異導(dǎo)致的攝入量不同,在MNNG溶液自由飲用的基礎(chǔ)上,聯(lián)合了灌胃的方法且此給藥途徑不參與饑飽失常,保證每日最低攝入量,最大程度控制誤差。除此之外,在自由飲用試劑和飼料的同時(shí),聯(lián)合饑飽失常法,饑飽失常是一種在正常進(jìn)食情況下,采取間歇性禁食的實(shí)驗(yàn)方法,模擬臨床上的不規(guī)律進(jìn)食病因,胃酸每天有固定的分泌時(shí)間,食物的粘度對胃排空率會造成一定的影響[23-25]。如果胃酸和胃蛋白酶沒有食物去進(jìn)行中和反應(yīng),就會直接酸化胃黏膜,引起胃黏膜下的血管收縮、痙攣等[26]。且空腹?fàn)顟B(tài)下的飲水使MNNG在胃中停留時(shí)間比有食物充盈時(shí)間縮短,MNNG對胃黏膜刺激減少,對腸道黏膜刺激增加,加重了MNNG致腸道腫脹的不良反應(yīng)[27]。故于禁食日宜停飲MNNG溶液,一般采用2～3 d進(jìn)食,1 d禁食的方案,也有采用雙日禁食,單日進(jìn)食的方法[28]。本方法的側(cè)重點(diǎn)在于對MNNG溶液給藥方式的聯(lián)合,以最大程度的控制MNNG溶液的定量攝入,是理想的給藥方式,但因給藥方式的聯(lián)合,故需要針對不同方式制定不同的濃度及試劑保存方式,對于自由飲用的MNNG溶液需要1周進(jìn)行1次溶解,18～24 h換1次水,對于灌胃用的溶液則需注意儲存方式,同時(shí)隨時(shí)觀察大鼠的毛發(fā)光澤、精神狀態(tài)等以調(diào)整濃度。

2.3 MNNG溶液灌胃+水楊酸鈉溶液自由飲用+高鹽燙飲食

任金剛等[29]采用SD大鼠自由飲用2%水楊酸鈉溶液配合10 mL/kg的MNNG溶液灌胃,每周禁食1次,自第14周起禁食第2天灌胃高鹽熱淀粉糊3 mL,給藥28周后造模成功。此方案的預(yù)實(shí)驗(yàn)中,MNNG溶液的給藥方式為自由飲用,但發(fā)現(xiàn)大鼠飲水量較少,認(rèn)為與溶液的刺激性氣味有關(guān),故改為灌胃。而水楊酸鈉無刺激性氣味,接受度高,最終采用聯(lián)合水楊酸鈉溶液自由飲用的方案。劉凱歌等[30]在研究胃癌轉(zhuǎn)化的機(jī)制中也選用了2%水楊酸鈉溶液灌胃的聯(lián)合造模方式,于第26周造模成功。水楊酸鈉溶液屬于非甾體類抗炎藥(NSAIDs),其機(jī)理為降低環(huán)氧化酶以活性消炎止痛,通過抑制胃粘膜因子的生長,直接刺激粘膜細(xì)胞壞死引起炎癥反應(yīng),故常用低劑量的水楊酸鈉溶液造成大鼠的胃炎反應(yīng)[31]。另外聯(lián)合高鹽燙的不良飲食習(xí)慣,獨(dú)思靜等[32]在實(shí)驗(yàn)的第九周用高鹽熱淀粉糊灌胃后,大鼠的胃泌素顯著降低。食鹽有過高的滲透壓,能抑制前列腺素E2的合成從而造成胃酸分泌不足,損傷胃黏膜,并結(jié)合食物中的硝酸鹽,在胃內(nèi)分泌出有強(qiáng)致癌性的亞硝酸銨[33-35]。另外過高溫度的食物會對消化道黏膜產(chǎn)生燙傷,反復(fù)的燙傷會引起黏膜的質(zhì)變,進(jìn)一步則會產(chǎn)生癌變,再加上淀粉糊狀物不易消化,容易引起胃腸道功能的紊亂,但糊狀物需要大半徑的灌胃針,若操作不當(dāng)易對大鼠食道造成額外傷害。此方案運(yùn)用灌胃方式結(jié)合易接受、攝入量高的水楊酸鈉溶液、加以高鹽燙飲食,雖造模時(shí)間較長,但在保證試劑致病量的前提下,以非甾體類抗炎藥和高熱燙因素聯(lián)合持續(xù)胃炎狀態(tài),與MNNG溶液配合效果良好。

2.4 MNNG溶液自由飲用+氨水自由飲用+乙醇灌胃+饑飽失常

孔祥茹等[36]取用SD大鼠以100 μg/mL的MNNG溶液自由飲用,每進(jìn)食2 d,再禁食1 d,禁食日用20%乙醇灌胃,每只2 mL,再用0.1%氨水自由飲用,持續(xù)28周后造模成功。此方案采用了自用飲用MNNG溶液的給藥方式,聯(lián)合氨水和乙醇,在饑飽失常的狀態(tài)下進(jìn)行。其中乙醇溶液起到輔助溶解MNNG溶液的作用,提高利用率,縮減一定的成本,但同時(shí)乙醇灌胃會導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變,血竇組織及其小葉中央靜脈產(chǎn)生病變[37-39]。乙醇和MNNG溶液會不同程度的造成大鼠胃腸脹氣,而且胃腸脹氣會導(dǎo)致大鼠撕咬從而造成死亡。故聯(lián)合乙醇溶液因素時(shí)應(yīng)慎重選擇乙醇濃度及干預(yù)頻率,且宜于禁食日停MNNG溶液改用20%乙醇灌[40]。其給藥方式為自由飲用,其一能降低大鼠死亡率,其二因其造模周期長,樣本量大,自由飲用的方式可縮減操作程序,最大程度的減少失誤[41]。再聯(lián)合氨水自由飲用可造成Hp感染狀態(tài)、聯(lián)合乙醇灌胃可輔助MNNG溶液更高效率的發(fā)揮作用,聯(lián)合饑飽失常能模擬不規(guī)律進(jìn)食對胃黏膜的損傷,且空腹飲水使得MNNG在胃中停留時(shí)間比食物充盈時(shí)間短,對腸道黏膜刺激增加,加重了MNNG致腸脹氣的不良反應(yīng),故此方案在上述因素聯(lián)合下能發(fā)揮成功的造模效果。

3 討論

目前關(guān)于PLGC大鼠模型的研究主要圍繞其造模周期、MNNG溶液的給藥方式、濃度及其聯(lián)合因素的應(yīng)用而展開。總結(jié)上述內(nèi)容發(fā)現(xiàn)胃癌前病變的造模周期通常跟隨給藥方式及濃度而變化。在實(shí)驗(yàn)中為了減小誤差,提高誘變率,MNNG溶液與其聯(lián)合溶液的給藥方式常呈交替式出現(xiàn),其濃度與劑量也根據(jù)給藥方式的不同而調(diào)整,自由飲用時(shí)濃度較低,劑量較高;灌胃時(shí)濃度較高,劑量較低。在聯(lián)合因素的選擇上,通常將飲食習(xí)慣、化學(xué)因素與物理因素三者結(jié)合起來,與致癌劑形成輔助作用,且在禁食日采用氨水或乙醇或水楊酸鈉溶液等聯(lián)合因素,但過程中要避免藥物之間的拮抗及毒性作用,合理準(zhǔn)確的聯(lián)合多因素造模才能縮短造模周期、減少資源損耗及提高成模效率。

4 小結(jié)

筆者認(rèn)為病理發(fā)生過程是由多因素同步且綜合作用下產(chǎn)生的表現(xiàn),這一點(diǎn)在胃癌前病變的過程中更加得到顯著體現(xiàn),它是從萎縮性胃炎到不完全大腸型化生到中度的異型增生再到癌變的一個漫長過程,所以癌前病變更是需要動態(tài)觀測其炎癌轉(zhuǎn)化的中間環(huán)節(jié),建立高效的動物模型是此研究前提和根基。目前PLGC大鼠造模主要圍繞MNNG溶液復(fù)合法進(jìn)行研究,但其造模周期、給藥濃度及途徑及聯(lián)合因素的選擇還未產(chǎn)生一個標(biāo)準(zhǔn),故采用MNNG溶液多因素復(fù)合法分析每套方案中每個因素的利弊,在復(fù)雜的研究中找到實(shí)驗(yàn)突破點(diǎn),在曲折的實(shí)驗(yàn)過程中找到研究創(chuàng)新點(diǎn),以建立更標(biāo)準(zhǔn)且高效的動物模型。