波生坦預(yù)防大鼠頸動(dòng)脈再狹窄與血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)性研究

張彥紅 吳桂平 付鑫 李穎 曲曉婷 王滌非

·論著·

波生坦預(yù)防大鼠頸動(dòng)脈再狹窄與血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)性研究

張彥紅 吳桂平 付鑫 李穎 曲曉婷 王滌非

目的探討波生坦對(duì)大鼠頸動(dòng)脈再狹窄的預(yù)防作用及與血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平的關(guān)系。方法36只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，損傷組和波生坦組。損傷組及波生坦組模擬臨床PTCA過(guò)程行左頸總動(dòng)脈球囊損傷，波生坦組給予波生坦100 mg/（kg·d）灌胃（術(shù)前1 d直至處死）。在此基礎(chǔ)上觀測(cè)術(shù)后7 d、14 d時(shí)內(nèi)膜面積管腔狹窄指數(shù)，并于術(shù)前及術(shù)后1周測(cè)定血清VEGF水平。結(jié)果波生坦組術(shù)后14 d血管內(nèi)膜面積及管腔狹窄指數(shù)顯著低于損傷組（P＜0.001）。術(shù)后7 d損傷組、波生坦組血清VEGF水平較術(shù)前顯著升高；波生坦組VEGF增幅高于損傷組，且術(shù)后7 d血清VEGF水平與管腔狹窄指數(shù)呈線性負(fù)相關(guān)。結(jié)論波生坦組可通過(guò)抑制血管內(nèi)膜過(guò)度增生、升高血清VEGF水平預(yù)防再狹窄，有利于術(shù)后血管再內(nèi)膜化。

波生坦； 再狹窄； 動(dòng)脈成形術(shù)； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)（Percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）已成為冠心病血管重建的重要手段，然而術(shù)后再狹窄發(fā)生率仍較高。再狹窄的形成是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，包括血管彈性回縮、炎性反應(yīng)、基質(zhì)沉積、血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)的血管重塑、血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）過(guò)度增殖在內(nèi)的諸多因素參與，其中內(nèi)皮損傷是再狹窄發(fā)生的始動(dòng)因素［1-2］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelia growth factor，VEGF）是一種糖蛋白，可以高效、特異地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖，使血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速修復(fù)，并發(fā)揮抗血小板聚集、釋放一氧化氮（NO）、間接抑制VSMC增殖和移行的作用。波生坦是一種非肽類非選擇性內(nèi)皮素受體阻斷劑，本研究就波生坦對(duì)大鼠頸動(dòng)脈再狹窄的影響及其與VEGF水平的關(guān)系進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性 Wistar大鼠 36只，體重為 330～450 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

二、實(shí)驗(yàn)試劑、藥品與器材

1.波生坦：購(gòu)自愛(ài)克泰隆藥品公司，批號(hào)：070312。

2.PTCA球囊導(dǎo)管（1.5 mm×20 mm）、冠狀動(dòng)脈PT導(dǎo)絲，購(gòu)自Cordis公司。

3.大鼠VEGF試劑盒，購(gòu)自武漢博士德公司。

三、分組、造型制備與藥物干預(yù)

選取健康雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、損傷組與波生坦組，每組12只。參照Clowes AW［3］方法模擬臨床PTCA制備頸總動(dòng)脈球囊損傷模型：將實(shí)驗(yàn)大鼠（損傷組，波生坦組）禁食8 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，尾靜脈注射肝素100 u/kg。沿中線切開頸部皮膚，在頸前三角區(qū)暴露左頸總頸內(nèi)，頸外動(dòng)脈，分離頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)段，用絲線暫時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈近心端血流，自頸外動(dòng)脈血管剪一“V”型小切口，置入導(dǎo)絲并插入近膈肌水平，沿導(dǎo)絲送入PTCA球囊導(dǎo)管至頸總動(dòng)脈約3 cm。肝素鹽水充盈球囊，予1.5 atm力擴(kuò)張30 s，緩慢回抽球囊至頸總動(dòng)脈分叉處，間歇60 s，重復(fù)3次，剝離內(nèi)膜，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近段，查看頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈搏動(dòng)良好后縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后常規(guī)肌注青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組僅暴露分離左頸總，頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈，之后縫合皮下組織及皮膚，喂食普通飼料，自由飲水。波生坦組大鼠自術(shù)前1天直至處死給予波生坦組100 mg/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和損傷組給予等量蒸餾水灌胃直至處死。

四、血清VEGF測(cè)定

術(shù)前及術(shù)后1周所有大鼠于尾靜脈采血1 ml，離心取血清-70℃保存，按說(shuō)明書嚴(yán)格操作，ELISA法測(cè)定血清VEGF值。

五、取材

術(shù)后7 d、14 d分批取材，首先經(jīng)尾靜脈注射5%Evan′s bule一生理鹽水標(biāo)記無(wú)內(nèi)膜覆蓋血管。30 min后用4%多聚甲醛以13.3 kPa后給進(jìn)行灌注固定，解剖并游離左右側(cè)頸總動(dòng)脈，切取左側(cè)頸總動(dòng)脈中段藍(lán)染區(qū)，行低溫石蠟垂直定向包埋，并以5μm厚度切片，常規(guī)HE染色。

六、動(dòng)脈壁內(nèi)膜面積的測(cè)量及狹窄指數(shù)的測(cè)定

按照組織學(xué)劃分，內(nèi)膜彈力膜以內(nèi)為血管內(nèi)膜，內(nèi)外彈力膜之間為中膜。在5X物鏡下將完整的血管橫切面HE染色圖像攝入計(jì)算圖像分析系統(tǒng)中（江蘇捷達(dá)圖象分析軟件），隨機(jī)選取動(dòng)脈藍(lán)染段3個(gè)切面分析，取平均值。測(cè)量血管內(nèi)膜面積（NIA）、內(nèi)彈力板圍繞面積（NILA）并計(jì)算管腔狹窄指數(shù)（SI），SI＝NIA/IELA。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS 11.0進(jìn)行方差分析處理，所得數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，自身前后比較采用對(duì)照t檢驗(yàn)，變量間關(guān)系，采用相關(guān)分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

36只大鼠分別因術(shù)中出血死亡1例，插入頸動(dòng)脈斷裂未完成造模1例，余22只大鼠成功建模：假手術(shù)組12只，損傷組11只，波生坦組11只。

一、術(shù)后內(nèi)膜面積比較

術(shù)后7 d損傷組與波生坦組內(nèi)膜面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后14 d損傷組與波生坦組內(nèi)膜面積均較術(shù)后7 d顯著增加（P＜0.001），但術(shù)后14 d波生坦組內(nèi)膜面積及管腔狹窄指數(shù)較損傷組顯著減?。≒＜0.01）。見(jiàn)表1、表2。

表1 術(shù)后7 d、14 d內(nèi)膜面積比較（mm2，±s）

表1 術(shù)后7 d、14 d內(nèi)膜面積比較（mm2，±s）

注：與損傷組相同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.001；與本組術(shù)后7 d比較，bP＜0.001

組別 例數(shù) 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d損傷組 12 0.031±0.007 0.106±0.009b波生坦組 12 0.031±0.006 0.103±0.011ab

表2 術(shù)后14 d內(nèi)膜面積及管腔狹窄指數(shù)（SI）比較（±s）

表2 術(shù)后14 d內(nèi)膜面積及管腔狹窄指數(shù)（SI）比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與損傷組比較，bP＜0.01

組別 例數(shù) 內(nèi)膜面積（mm2）SI假手術(shù)組12 0.019±0.00 0.107±0.023損傷組 12 0.106±0.009 0.513±0.036a波生坦組 12 0.103±0.011 0.302±0.045b

二、血清VEGF水平比較及與術(shù)后14 d管腔狹窄指數(shù)的相關(guān)性

術(shù)前3組血清VEGF水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后7 d損傷組、波生坦組血清VEGF水平較術(shù)前顯著升高（P＜0.01），波生坦組VEGF升高幅度大于損傷組（P＜0.01）。術(shù)后7 d時(shí)VEGF水平與14 d時(shí)管腔狹窄指數(shù)成負(fù)相關(guān)（r＝-0．972，P＜0．01）。見(jiàn)表3、表4。

表3 術(shù)前、術(shù)后7 d血清VEGF水平比較（pg/m l，±s）

表3 術(shù)前、術(shù)后7 d血清VEGF水平比較（pg/m l，±s）

注：與同組術(shù)前比較，aP＜0.01；與損傷組比較，bP＜0.01

組別 例數(shù) 術(shù)前 術(shù)后7 d假手術(shù)組12 26.72±4.22 26.69±4.20損傷組 12 26.83±6.01 76.22±15.2a波生坦組 12 27.63±6.27 133.52±12.75b

表4 術(shù)后7 d VEGF水平與14 d SI的關(guān)系（±s）

表4 術(shù)后7 d VEGF水平與14 d SI的關(guān)系（±s）

組別 例數(shù) 術(shù)后7 d VEGF（pg/ml） 術(shù)后14 d SI（mm2）損傷組12 76.22±15.2 0.513±0.036波生坦組12 133.52±12.75 0.302±0.045

討 論

冠脈介入治療術(shù)后再狹窄的發(fā)生是涉及血管彈性回縮。炎癥反應(yīng)，基質(zhì)沉積，血管重塑，血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖等多因素，多環(huán)節(jié)的復(fù)雜病理生理過(guò)程。研究表明PTCA過(guò)程中造成的內(nèi)皮損傷是再狹窄發(fā)生的始動(dòng)因素。臨床以上抗血管平滑肌細(xì)胞增殖為目的的治療，如藥物涂層支架及內(nèi)放射支架的使用在一定程度上解決了血管的彈性回縮并通過(guò)抑制VSMC的過(guò)度增殖降低了再狹窄的發(fā)生率，但同時(shí)也抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的正常增殖，有研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)放射及雷帕霉素防治再狹窄過(guò)程中出現(xiàn)內(nèi)皮修復(fù)延遲［3-4］，由此產(chǎn)生的晚期血栓形成、支架內(nèi)膜化不完全、炎癥反應(yīng)，引發(fā)了人們對(duì)藥物涂層支架遠(yuǎn)期療效的質(zhì)疑。所以針對(duì)再狹窄發(fā)生的始動(dòng)因素-內(nèi)皮損傷的治療可有效地促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)，改善內(nèi)皮功能而達(dá)到預(yù)防再狹窄的目的。

VEGF是一種糖蛋白，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它能夠高效、特異地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂，增殖，抑制多種因素導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)過(guò)氧化物的耐受性，使血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速修復(fù)并發(fā)揮功能：擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集，抗血栓，間接抑制VSMC增殖和移行，防止炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和有害物質(zhì)透入，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放NO，進(jìn)一步發(fā)揮擴(kuò)張血管，抑制血小板粘附、聚集，抑制血細(xì)胞粘附及VSMC增生和移行的作用［5］。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VEGF及其基因能加速動(dòng)脈成形術(shù)后的血管內(nèi)皮的修復(fù)，使血栓形成及血栓性閉塞減少，并抑制內(nèi)膜增生［6］。

波生坦是一種非肽類非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑，它可對(duì)抗內(nèi)皮素強(qiáng)烈的縮血管作用和促血管平滑肌增生的作用。本實(shí)驗(yàn)顯示波生坦組14 d的內(nèi)膜面積及管腔狹窄指數(shù)均明顯低于損傷組，提示波生坦可有效抑制血管新生內(nèi)膜的過(guò)度增生。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)顯示損傷組和波生坦組術(shù)后7天時(shí)血清VEGF濃度顯著高于術(shù)前，且波生坦組VEGF升高幅度大于損傷組，提示球囊損傷后通過(guò)VEGF的升高，以加速損傷內(nèi)皮的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)顯示術(shù)后7 d波生坦組血清VEGF水平與術(shù)后14 d管腔狹窄指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，提示早期升高VEGF水平可降低管腔丟失，預(yù)防再狹窄，而波生坦在一定程度上具有升高VEGF的作用，但具體機(jī)制尚不明確。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)波生坦通過(guò)抑制動(dòng)脈新生內(nèi)膜的過(guò)度增生，升高血清VEGF水平，可有效預(yù)防再狹窄，并有利于介入術(shù)早期再內(nèi)膜化。如相關(guān)大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)最終能證實(shí)該作用，將有助于提高冠脈介入術(shù)的療效。

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張彥紅，吳桂平，付鑫，等.波生坦預(yù)防大鼠頸動(dòng)脈再狹窄與血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)性研究［J/CD］.中華心臟與心律電子雜志，2017，5（1）：44-46.

Effect of Bosentan on Carotid A rtery Restenosis in Rat and Correlation of Serum VEGF

Zhang Yanhong，Wu Guiping，F(xiàn)u Xin，Li Yin，Qu Xiaoting，Wang Difei．
Department of Cardiology，Shenzhou Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110002，China

Zhang Yanhong，Email：yhzhang＠126．com

ObjectiveTo investigate the effect of Bosentan on carotid artery restenosis in rat and correlation of serum vascular endothelia growth factor（VEGF）.Methods36 Wistar rats were divided randomly into 3 groups：control group，injured group and Bosentan group.Bosentan was administrated intragastricly to rats of Bosentan group.The balloon catheter injury was performed on left common carotid artery of rat by imitating the process of angioplasty.After 7 days，14 days neointimal area（NIA）and stenosis index（SI）was calculated.Before and 7days after balloon injury，serum VEGF were detected.ResultsNIA and SI of Bosentan group were significantly decreased compared with injury group（P＜0.001）.Serum VEGF level significantly increased 7days after balloon injury both in injure group and Bosentan group.The increase rang in Bosentan group was higher than that in injury group（P＜0.01）.The serum VEGF level 7days after injury had linearly negatiuve correlation with SI.ConclusionBosentan is effective on artery restenosis by inhibiting neointimal hyperplasis and increasing the serum VEGF level.

Bosentan； Restenosis； Angioplasty； VEGF

10.3877/cma.j.issn.2095-6568.2017.01.013

110002 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院心血管內(nèi)科

張彥紅，Email：yhzhang＠126.com