NKx2.5基因的生物學(xué)特征及在心臟發(fā)育中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

朱業(yè)，顧翔*

(1揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)系，江蘇 揚(yáng)州 225001；2蘇北人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 揚(yáng)州 225001)

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育的過(guò)程是由特定的信號(hào)分子啟動(dòng)，組織特異性轉(zhuǎn)錄因子在心肌細(xì)胞的形成、心前細(xì)胞的遷移和分化、心臟瓣膜及房室分隔的發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[1]。其中NKx2.5基因是最早被發(fā)現(xiàn)與心臟的發(fā)育和成熟有關(guān)，在心臟發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子之一。本文綜述了NKx2.5基因的生物學(xué)特征及其在心臟發(fā)育中的作用機(jī)制。

1 NKx2.5生物學(xué)特征

NKx2.5基因是NK同源核基因家族NKx2的成員，是早期心臟祖細(xì)胞分化的標(biāo)志之一[2]。NKx2.5基因定位于人染色體5q34-35上，它在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，常被稱(chēng)為心臟特異性同源盒基因或CSX同源基因，它有兩個(gè)外顯子發(fā)揮著重要作用，互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)全長(zhǎng)1 585 bp，它能編碼324個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[3]。NKx2.5基因編碼蛋白有4類(lèi)高度保守的結(jié)構(gòu)域，包括N端的TN結(jié)構(gòu)域、160個(gè)氨基酸組成的同源盒結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)域下游的NK2-SD和C端含有GI-RAW保守的結(jié)構(gòu)域。同源結(jié)構(gòu)域與靶基因中的順式作用元件序列 (5′-TNAAGTG-3′)的相應(yīng)序列結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。這種蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合的最有意義的氨基酸包括天冬氨酸及賴(lài)氨酸等。NKx2.5還有一個(gè)富含丙氨酸和脯氨酸殘基的阻遏結(jié)構(gòu)域，以及富含上述兩種氨基酸和天冬氨酸、谷氨酸殘基的激活域。它們的變化將引起蛋白質(zhì)-DNA間親和力的改變，影響基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而產(chǎn)生相關(guān)蛋白的缺陷，形成心臟畸形[4]。NKx2.5的表達(dá)也受GATA因子和SMAD蛋白以及NKx2.5自身的調(diào)控等，形成一個(gè)完整的自主調(diào)節(jié)回路。NKx2.5還與其他關(guān)鍵的心臟轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合作用共同促進(jìn)心肌細(xì)胞分化和房室鑒定。

2 NKx2.5 在心臟發(fā)育中的作用

同源域蛋白NKx2.5調(diào)控心臟發(fā)育的多個(gè)方面，包括心臟前體細(xì)胞和流出道的形成等。NKx2.5基因具有在心臟特異性表達(dá)特點(diǎn)，NKx2.5表達(dá)最早見(jiàn)于脊椎動(dòng)物心臟頭褶期心肌源性前體細(xì)胞，并在心肌細(xì)胞分化的各個(gè)階段均持續(xù)表達(dá)。它涉及房室前體細(xì)胞的分化與分離、負(fù)責(zé)維持正常心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)和復(fù)雜的功能。NKx2.5位于眾多心臟結(jié)構(gòu)基因的上游，參與了心臟祖細(xì)胞的分化、房室間隔、房室流出道和傳導(dǎo)系統(tǒng)的形成，維持了成人心臟的正常結(jié)構(gòu)功能。通過(guò)調(diào)控它們的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)心臟的發(fā)育。如肌鈣蛋白C(cardiac troponin C, cTnC)、心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)以及心臟特異轉(zhuǎn)錄因子如MLC2V、BMP10及TBX5等。

Terada等[5]利用他莫西芬誘導(dǎo)胚胎發(fā)育第12.5天的小鼠NKx2.5基因敲除，發(fā)現(xiàn)小鼠在第16天時(shí)出現(xiàn)心律失常和結(jié)構(gòu)異常，第17.5天時(shí)死亡。NKx2.5基因敲除小鼠表現(xiàn)為環(huán)化后的血管發(fā)育異常和心臟發(fā)育滯后，并在心臟完全環(huán)化前死亡。既往研究還證實(shí)了使用他莫西芬誘導(dǎo)NKx2.5敲除小鼠，NKx2.5不僅在心臟發(fā)育期間發(fā)揮關(guān)鍵作用，也在圍產(chǎn)期心臟通過(guò)調(diào)控幾個(gè)重要基因產(chǎn)物的表達(dá)調(diào)節(jié)心臟的傳導(dǎo)和收縮功能[6]。此外，Kasahara等[7]在NKx2.5基因的過(guò)表達(dá)后，出現(xiàn)了房室傳導(dǎo)阻滯和心臟結(jié)構(gòu)缺陷等表型。較早有報(bào)道NKx2.5基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致成人心肌肥厚[8]，由此可見(jiàn)，NKx2.5基因的缺失或過(guò)表達(dá)均可能對(duì)心臟的正常形態(tài)、結(jié)構(gòu)和傳導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響。

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是胎兒發(fā)育期間，心臟或大血管的異常形態(tài)和結(jié)構(gòu)，出生缺陷造成了心臟功能的實(shí)際或潛在的影響，為目前嬰幼兒死亡的首要原因[9]。心臟的形成過(guò)程依賴(lài)精確的基因遺傳編排，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互協(xié)調(diào)，信號(hào)通路和染色質(zhì)重構(gòu)等。在人類(lèi)CHD患者基因型的研究中發(fā)現(xiàn)，NKx2.5等位基因變異可造成房室間隔缺陷、心肌纖維排列異常及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育異常等，同時(shí)心律失常高于正常的發(fā)生率。NKx2.5基因雜合子小鼠可出現(xiàn)進(jìn)展性的房室傳導(dǎo)阻滯，其基因表型與NKx2.5基因變異的心律失?；颊弑硇鸵恢?。

研究表明，心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化的多向潛能干細(xì)胞均表達(dá)NKx2.5轉(zhuǎn)錄因子[10]。NKx2.5轉(zhuǎn)錄因子能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。NKx2.5轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)錄因子可以抑制心肌細(xì)胞纖維化,使心肌細(xì)胞及功能處于動(dòng)態(tài)平衡當(dāng)中。另有研究發(fā)現(xiàn), 心肌缺血后, 有NKx2.5表達(dá)陽(yáng)性的干細(xì)胞遷移到梗死灶, 并且分化為心肌細(xì)胞[11]，由此說(shuō)明心肌中NKx2.5表達(dá)陽(yáng)性的干細(xì)胞具有向心肌細(xì)胞分化的潛能。

3 NKx2.5與其他轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用

心臟發(fā)育需要不同轉(zhuǎn)錄因子之間在空間和時(shí)間上相互作用來(lái)調(diào)控下游靶點(diǎn)，而轉(zhuǎn)錄因子相互作用發(fā)生障礙可能導(dǎo)致各種CHD類(lèi)型[12]。既往有研究表明，NKx2.5與其他多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之間存在相互作用[13]。NKx2.5具有啟動(dòng)子依賴(lài)性，而且復(fù)雜的順式調(diào)節(jié)作用在心肌細(xì)胞的基因表達(dá)中有重要地位。在GATA-4、NKx2.5基因中互相包含啟動(dòng)二者特異性表達(dá)所必需的結(jié)合位點(diǎn)，不同轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，共同調(diào)節(jié)著胚胎心臟表型發(fā)育過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)錄[14]。

NKx2.5通過(guò)同源域與GATA-4和Tbx5轉(zhuǎn)錄因子在生理上協(xié)同作用，其相互作用可避免CHD的發(fā)生。比如在小鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育和維持中，Nkx2.5功能在轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)中需要與Tbx5和Id2的相互作用。事實(shí)上，NKx2.5突變使同源域受到影響，導(dǎo)致了GATA4和Tbx5的相互作用明顯下降。GATA-4在心臟譜系與NKx2.5共表達(dá)，GATA-4和NKx2.5相互依存共同發(fā)揮作用，在NKx2.5的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子含有限制性心臟鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA-4的高親和性結(jié)合位點(diǎn)，NKx2.5的心臟特異性上游增強(qiáng)子在線(xiàn)性心管和環(huán)化的過(guò)程中處于活化狀態(tài)。體外試驗(yàn)表明，NKx2.5基因的表達(dá)可以啟動(dòng)心肌的發(fā)生，并且在心肌分化過(guò)程中激活MEF2C基因，而MEF2C基因的表達(dá)在啟動(dòng)心肌發(fā)生的同時(shí)可以上調(diào)NKx2.5、GATA4、α-肌動(dòng)蛋白和主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)的表達(dá)，NKx2.5通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子MEF2C的直接相互作用控制心室的形成[15]。另外，NKx2.5的上游轉(zhuǎn)錄抑制因子Shox2的突變會(huì)影響其在竇房結(jié)中表達(dá)，導(dǎo)致妊娠中期胚胎致死率與小鼠嚴(yán)重竇房結(jié)發(fā)育不良和相關(guān)心率異常[16]。

通過(guò)對(duì)不同心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子的基因測(cè)序，“受影響”畸形心臟組織的基因經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的突變，在同一患者心臟中未受影響的組織中卻未發(fā)現(xiàn)這種基因突變，這表明體細(xì)胞嵌合體和體細(xì)胞起源的突變。許多患者可檢測(cè)出多個(gè)有害突變，而且存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因突變[17]。具體地說(shuō),常見(jiàn)的心臟畸形與NKx2.5突變有關(guān)的分別是房室傳導(dǎo)阻滯、房間隔缺損和室間隔缺損。但是同樣的結(jié)構(gòu)異常中也可發(fā)現(xiàn)其他轉(zhuǎn)錄因子的突變。房間隔缺損與GATA4、TBX5和ZIC3的突變相關(guān)，房室傳導(dǎo)阻滯與NKx2.5和TBX5突變有關(guān)，或者室間隔缺損與GATA4和TBX5突變有關(guān)。

4 NKx2.5基因突變與心臟病的關(guān)系

自1998年人類(lèi)首次在CHD患者身上發(fā)現(xiàn)NKx2.5突變，研究者們一直致力于探索NKx2.5編碼區(qū)與疾病相關(guān)的其他序列突變[18]。同一種CHD可存在不同的NKx2.5基因突變，而相同的NKx2.5基因突變可以有不同的CHD表現(xiàn)型。不同的心臟畸形甚至可引起相同的突變，由此證明了修飾基因和表觀(guān)遺傳效應(yīng)導(dǎo)致疾病有不同的表現(xiàn)。

據(jù)報(bào)道，全球迄今至少有50種NKx2.5基因存在錯(cuò)義突變，國(guó)外存在4%的突變率，相對(duì)而言我國(guó)CHD患者NKx2.5基因突變則較少。在散發(fā)型單純性CHD 患者中，孫淼等[19]研究是國(guó)內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)的見(jiàn)于散發(fā)單純性CHD 患者的NKx2.5基因突變，且不同于國(guó)外報(bào)道的已知突變位點(diǎn)。在58例CHD患者中發(fā)現(xiàn)堿基缺失突變p.Pro283Gln 位于NKx2.5 的第2個(gè)螺旋，嚴(yán)重影響DNA序列與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式和程度，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過(guò)程失控，下游基因表達(dá)異常，相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)缺陷從而導(dǎo)致CHD的發(fā)生。此外，國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在各種CHD患者中都存在NKx2.5外顯子1基因突變[20]。而國(guó)內(nèi)研究中卻并未發(fā)現(xiàn)NKx2.5 基因的外顯子1發(fā)生突變[21]。由此可見(jiàn)，NKx2.5基因突變位點(diǎn)的檢出還存在明顯地域和種族差異。隨著NKx2.5基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的闡明，更多的研究已轉(zhuǎn)向NKx2.5基因功能及調(diào)節(jié)作用機(jī)制。CHD患者中有3%存在NKx2.5基因突變，這些CHD包括房室傳導(dǎo)異常的房間隔缺損、室間隔缺損、右室雙出口、三尖瓣畸形、法洛四聯(lián)癥以及椎干心臟畸形等[22]。超過(guò)一半的NKx2.5突變是家族性的，家系中也存在特定的突變遺傳。Rochais等[23]對(duì)230例法洛四聯(lián)癥患者的NKx2.5基因進(jìn)行檢測(cè), 經(jīng)遺傳分析發(fā)現(xiàn)突變頻率為0.9%。NKx2.5是目前發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)與家族性房間隔缺損有關(guān)的心臟轉(zhuǎn)錄因子，目前共發(fā)現(xiàn)家族性房間隔缺損研究中有33個(gè)突變，散發(fā)的房間隔缺損研究中有8個(gè)突變[24]。

事實(shí)上一直以來(lái)，NKx2.5突變并不是CHD所獨(dú)有。NKx2.5突變?cè)诩谞钕侔l(fā)育不良以及未發(fā)現(xiàn)心臟異常的患者中均有發(fā)現(xiàn)，從而提示了NKx2.5在器官發(fā)生和病理生理發(fā)展中均發(fā)揮了廣泛作用[25]。正如Simmons等[26]認(rèn)為生殖系突變可能并不與發(fā)育中的胚胎的存活相一致，可能的原因?yàn)楹芏嗫刂菩呐K發(fā)育的基因在其他器官系統(tǒng)發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用，在任何情況下不太可能僅僅引起CHD而已?？偠灾瑔蝹€(gè)種系NKx2.5突變作為引起疾病的直接原因或是單靠孟德?tīng)栠z傳可能不足以解釋疾病的發(fā)病機(jī)制[27]。

NKx2.5的突變也存在于擴(kuò)張型心肌病或室性心律失常的患者，而且最終可能導(dǎo)致心源性猝死[28]。15%的患者發(fā)生心源性猝死有遺傳性房間隔缺損和房室傳導(dǎo)阻滯[29]。房間隔缺損和心源性猝死家族有44%存在NKx2.5突變。但是到目前為止，還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道認(rèn)為突變等位基因和表型的嚴(yán)重程度有關(guān)[30]。遺傳性房間隔缺損，或伴房室傳導(dǎo)阻滯的房間隔缺損患者，NKx2.5基因檢測(cè)將有助于預(yù)測(cè)室性心律失?；蛐脑葱遭繹31]。如果他們是基因突變攜帶者，可預(yù)防性地在這些患者體內(nèi)植入心臟復(fù)律除顫儀[32]。

綜上，組織特異性NKx2.5同源核蛋白是心肌細(xì)胞前體最早的標(biāo)記，是心臟形成的關(guān)鍵，它在心臟發(fā)育過(guò)程中與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，與心肌特異基因的調(diào)控表達(dá)在一起，共同促進(jìn)前體心肌細(xì)胞的發(fā)育。早期進(jìn)行NKx2.5基因檢測(cè)將有助于早期診斷和治療遺傳性CHD，預(yù)防心動(dòng)過(guò)緩或過(guò)速導(dǎo)致的心源性猝死。