骨軟骨組織工程的研究進展

曹家全，王景燕，高海明，王 波，吳佳奇

(西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

軟骨損傷(cartilage damage)是創(chuàng)傷骨科十分常見的疾病。由于其再生能力差的生理特性，以及缺乏神經支配，當軟骨表面受損后疼痛感不明顯，使得患者未能得到及時的診斷和有效的治療，導致?lián)p傷進行性加重，繼而會出現(xiàn)關節(jié)變形甚至功能障礙等一系列并發(fā)癥。但軟骨組織工程技術的出現(xiàn)為修復軟骨和軟骨缺損帶來新突破[1]。組織工程(tissue engineering)是近年來正在興起的一門新的學科，屬于生物高技術范疇。此概念最早是在1987年美國科學基金會在華盛頓舉辦的生物工程小組會上提出，1988年正式被命名定義。組織工程技術的研究應具備以下三個主要條件：(1)足夠數(shù)量且具備多向分化潛能的種子細胞；(2)合適的生物支架載體；(3)調節(jié)種子細胞增殖并維持其表型等特征的生長因子。

1 種子細胞

種子細胞是組織工程學中的第一個核心要素，也是組織工程學發(fā)展的瓶頸[2]。種子細胞可以分為非干細胞和干細胞兩大類[3]。前者主要包括：成纖維細胞、內皮細胞、軟骨細胞。后者主要包括：骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、脂肪干細胞(adipose stem cells，ADSCs)、神經干細胞和胚胎干細胞等。在上述種子細胞中，骨髓間充質干細胞的研究最為成熟，已經廣泛地應用于基礎研究[4]。骨髓間充質干細胞最早由Friedenstein等[5]在骨髓中發(fā)現(xiàn)。大量研究顯示[6]，骨髓間充質干細胞被認為是多功能干細胞，可以誘導分化為神經細胞、肝臟細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞，甚至心肌細胞。由于具有多向分化，自我更新，免疫調節(jié)和其他作用的潛力，骨髓間充質干細胞已成為基因治療，組織工程，細胞替代治療和再生醫(yī)學的種子細胞重要來源[7]。由于骨髓間充質干細胞的提取、分離及純化過程較為復雜，存在細胞被感染、老化、數(shù)量不足等缺點，因此來源受到一定的限制。脂肪干細胞存在于脂肪組織中,是具有多向分化潛能的成體干細胞[8]；在一定條件下，也有向骨、軟骨、內皮細胞及脂肪細胞等多向分化潛能，且具有取材容易、來源廣泛、供應量充足、供區(qū)創(chuàng)傷小、免疫調節(jié)能力強等一系列骨髓間充質干細胞沒有的優(yōu)勢[9]。因此，脂肪干細胞也可以作為骨組織工程理想的種子細胞來源。但其成骨能力遠遠不如骨髓間充質干細胞，在骨組織工程中不作為種子細胞首選[10]。

通常情況下，軟骨細胞被當做軟骨組織修復的最佳種子細胞選擇，但實際上，軟骨細胞的來源和取材均有限，取材后容易造成供區(qū)功能障礙；此外，細胞分離過程較為復雜，可能造成不可逆地損傷，在體外進行培養(yǎng)增殖過程中容易喪失軟骨細胞特有的表型[11-12]。

2 合適支架

選擇合適的材料是軟骨組織重建的關鍵。目前常用的軟骨組織工程支架材料主要有天然高分子材料(比如藻酸鹽、殼聚糖、膠原、明膠、纖維蛋白膠、天然脫細胞基質材料等)和人工合成材料(比如聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (polylactic acid-glycolic acid copolymer，PLGA)、聚己酸內酯(polycaprolactone，PCL)等)[13]。然而，作為修復軟骨缺損的金標準，自體移植物具有更好的成骨性，有較好的骨誘導性和骨傳導性[14]。盡管，同種異體移植物和異體移植物具有一定的成骨能力，但具有包括降解速度慢、材料穩(wěn)定性差、免疫排斥等缺點[15]。當前，經過特殊處理的自體或同種異體骨具有較好的生物強度和機械強度(例如生物相容性和生物降解性)，能降低供體部位發(fā)病率或病原體傳播風險，是一種天然、綠色和安全的材料[16-17]。因此，同種異體骨支架成為軟骨組織工程較理想的選擇，也成為當前研究員的研究熱點。

理想的骨組織工程支架應緊密模仿天然的骨骼環(huán)境。支架材料的選擇是組織工程技術最核心問題，它不僅作為細胞的載體，而且對細胞的黏附、增殖、分化和表型的維持具有十分重要作用[18]。用于骨組織工程的理想支架應滿足以下要求[19-20]：(1) 具有良好的界面親和力，有利于種子細胞黏附、生長及分化；(2)具有穩(wěn)定且足夠的三維空間結構，有利于組織生長、物質移植和血管形成；(3)具有一定的生物力學特性和良好的生物可降解性，在缺損部位能夠提供一定的力學強度，維持重建組織的形態(tài)，且易于降解；(4)具有良好的生物相容性，不引發(fā)炎癥反應以及較低的免疫原性，能夠較好的和受體相結合，確保修復組織的連續(xù)性和穩(wěn)定性；(5)應具有調節(jié)生物活性因子的釋放；(6)支架應易于制備成各種想要的形狀和尺寸。由于組織來源的支架和天然組織的結構和組成十分相似。因此，組織來源的支架在生物醫(yī)學應用中具有廣闊的前景。然而，自體組織衍生的支架也具有許多移植的缺點，因為收獲自體移植物限于可用的供體部位并且需要二次手術，因此對身體也會造成額外的損害[21]。

3 生長因子

生長因子已經被證實在組織工程技術中有十分重要的作用，尤其是在軟骨修復方面得到了大量的驗證。生長因子是指具有調控細胞生長、發(fā)育的一類生物活性物質，它們通過自分泌或旁分泌方式調節(jié)各種細胞的增殖和分化[22]。目前，骨組織工程中常用的生長因子包括：轉化生長因子 (transforming growth factor, TGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、富血小板血漿(platelet rich Plasma，PRP)、富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin，PRF)等，大量研究表明[23]生長因子不僅可以促進細胞的生長、增殖及分化，而且多種生長因子協(xié)同作用可以有效地誘導干細胞向軟骨分化并維持軟骨細胞表型。

轉化生長因子(TGF)是一種多肽類生長因子，可根據(jù)其組織結構的不同分為TGF-α和TGF-β兩種類型。它們能有效地促進細胞的生長、增殖及分化，是干細胞向軟骨分化的關鍵因子。在軟骨組織工程中TGF-β1和TGF-β3的應用較為廣泛，但其中TGF-β1可顯著增加軟骨相關的基因表達。Worster等[24]對BMSCs體外培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入TGF-β1可以誘導BMSCs定向分化為軟骨細胞，其II型膠原(COLⅡ)的表達與 TGF-β1的劑量呈正相關，5～10 ng/mL的TGF-β1，可有效地促進BMSCs向軟骨方向的分化。而TGF-β3主要對BMSCs向軟骨分化起調節(jié)作用，其參與了軟骨分化中的細胞聚集、增殖和分化階段；鄭東等[25]通過特定方式從大鼠胚胎組織中獲取TGF-β3的基因片段并轉染至大鼠來源的ADSCs中相應的DNA片段(重組質粒)中，將轉染后的ADSCs在特定的環(huán)境下進行培養(yǎng),分別于第7、14、21天進行免疫組化染色，與對照組相比，實驗組的COLⅡ、Aggrecan、TIMP的表達明顯增加，表明了TGF-β3有促進ADSCs向軟骨細胞分化和軟骨基質的能力。艾力麥爾旦·艾尼瓦爾等人[26]在一系列體外實驗發(fā)現(xiàn)，濃度在10～100 μg/L范圍內的TGF-β3可有效促進兔成骨細胞的增殖和成骨能力,其中TGF-β3的質量濃度為10 μg/L時，Ⅰ型膠原蛋白、Runx-2、骨鈣素基因的表達最明顯。

成纖維細胞生長因子(FGF)由垂體和下丘腦分泌的多肽。包括堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)兩種，能促進成纖維細胞有絲分裂、中胚層細胞的生長，還可刺激血管形成，在創(chuàng)傷愈合及骨軟骨缺損修復和再生中發(fā)揮重要作用。目前，F(xiàn)GF在現(xiàn)代臨床醫(yī)學、外科手術及醫(yī)學美容中發(fā)揮著不可估量的巨大作用[27]。此外，bFGF也常用于軟骨組織工程，其中FGF2和FGF18與關節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)維持密切相關[28]。戶小偉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，bFGF能促進BMSCs向成骨細胞分化，并呈時間依賴性；其最佳作用濃度為50 ng/mL。bFCF可刺激成纖維母細胞的生成，是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血管生長因子之一，能促進骨、軟骨、神經和軟組織修復[30]?？杉ぐl(fā)促進BMSCs向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的潛能，具有體內、外誘導成骨和成血管作用，因此可以促進骨修復。周琦琪等[31]研究發(fā)現(xiàn)，bFGF能明顯增加BMSCs的增殖速度。雖然，多個實驗研究表明[32]，bFCF有明顯促進BMSCs向軟骨分化的潛能，但過程十分復雜，仍然是臨床上一個難點，具體機制及臨床效果仍需進一步研究，以闡明體內和體外軟骨再生的最佳策略。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是在1963年由美國的Marshall R.Urist教授發(fā)現(xiàn)的一種分泌性的多功能蛋白，對于骨和軟骨組織的生長具有重要作用。目前為止，已被發(fā)現(xiàn)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白至少有20種，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋2,4,6,7和9研究最為廣泛[33]。在一定條件能夠誘導形成軟骨、肌腱、韌帶等組織結構，甚至能參與相應神經及內臟組織的修復工程[34]。在骨科領域中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白的臨床應用主要在治療新鮮骨折、骨缺損、骨不連、脊柱融合及股骨頭缺血性壞死等5個方面[35]。阮世強等[36]通過BMP2基因過表達的方式刺激脂肪干細胞，同時結合Mosaicplasty技術可顯著促進軟骨缺損修復，即轉染BMP2對骨軟骨的缺損有更佳的臨床修復效果。Kemiss等[37]運用BMP6成功地誘導小鼠脂肪干細胞分化成骨細胞和軟骨細胞，表明BMP6有促進脂肪干細胞向成骨和成軟骨分化的潛能。其中，BMP9作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的關鍵分子,具有極強的促進干細胞分化與骨組織再生的能力[38]。BMP9主要通過BMP9-SMAD信號通路和BMP9-MAPK信號通路來實現(xiàn)對干細胞分化的調控作用[39]。BMPs具有較高的安全性和有效性，在骨與軟骨工程中具有較高的臨床價值，也是當今骨科研究的熱點之一，其過程較為復雜，有待進一步更加深入研究。

近年來，富血小板血漿(PRP)和富血小板纖維蛋白(PRF)也廣泛應用在軟骨組織工程方面，其含有大量的生長因子，如血小板衍生生長因子(PDGF)，轉化生長因子-β(TGF-β)，類胰島素生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF)，血管內皮生長因子(VEGF)等，可有效的促進骨折愈合、軟骨細胞增殖及軟骨細胞外基質合成[40-41]。

4 結論

綜上所述，組織工程應具備三個基本要素：較強增殖能力和多向分化潛能的種子細胞，生物相容性良好的細胞支架及促進細胞增殖分化的細胞因子，其中種子細胞和生物支架是最為重要的因素，是構建組織工程生物替代物獲得成功的前提條件。然而在臨床工作中，不易找到合適的替代物，導致骨軟骨組織工程技術的發(fā)展緩慢，且患者的治療效果很難達到滿意的效果。隨著材料科學和細胞生物學的發(fā)展和創(chuàng)新，骨組織工程技術為軟骨、軟骨下骨損傷的再生和修復帶來了新的希望。本文總結近幾年來國內外骨組織工程技術的研究進展，為軟骨及軟骨下骨的重建和修復的基礎研究及臨床應用提供可靠的依據(jù)。