CC16在慢性氣道疾病發(fā)病機(jī)制中的作用及臨床應(yīng)用前景

崔 博 馬 圓 陳智鴻

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科 上海 200032）

克拉拉細(xì)胞分泌蛋白16（clara cell secretory protein-16，CC16）可稱為CC10、子宮珠蛋白、club細(xì)胞分泌蛋白（club cell secretory protein，CCSP）、尿蛋白1和人類蛋白1［1］。CC16是club細(xì)胞分泌的主要蛋白，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化等多種生物學(xué)功能。主要在人體肺、氣管、前列腺、子宮內(nèi)膜和腎臟等多種組織器官中表達(dá)，其在肺和氣管的表達(dá)水平相比其他組織器官高出約20倍。CC16在延緩慢性氣道炎癥進(jìn)展中起到重要作用，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制促炎因子IL-8、阻斷NF-κB信號(hào)通路、抑制磷脂酶A 2（phospholipaseA 2，PLA 2）的激活等多種途徑發(fā)揮抗炎作用。近年來(lái)，CC16在慢性氣道疾病發(fā)病機(jī)制中的作用成為研究熱點(diǎn)，或?qū)⒊蔀榕袛嗦詺獾兰膊『头喂δ苷系K的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

CC16的結(jié)構(gòu)CC16的主要來(lái)源club細(xì)胞是一種無(wú)纖毛、無(wú)黏液分泌的棒狀細(xì)胞，存在于從鼻腔到呼吸道細(xì)支氣管的呼吸道上皮中。CC16是一種相對(duì)分子質(zhì)量為15 800的同二聚體，屬于分泌珠蛋白亞家族，是一種具有相同的70個(gè)氨基酸亞基的同二聚體蛋白質(zhì)，通過(guò)Cys3和Cys69'以及Cys3'和Cys69'之間形成的兩個(gè)二硫鍵以反平行方向連接。每個(gè)亞單位形成3個(gè)α螺旋，在第2個(gè)和第3個(gè)α螺旋之間有一個(gè)β旋轉(zhuǎn)。這兩個(gè)二硫鍵橋穩(wěn)定了CC16二聚體，并形成一個(gè)中心疏水空腔，其中包含Tyr’21和Tyr21’。這個(gè)空腔可以容納疏水小分子，如黃體酮、多氯聯(lián)苯或視黃醇［2］。雖然這些疏水空腔的生物學(xué)功能還未完全闡明，但研究發(fā)現(xiàn)配體［如前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2）］可被空腔容納，從而降低其活性，阻斷下游NF-κB通路并進(jìn)一步抑制炎癥相關(guān)基因環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）的表達(dá)［3］。另一方面，分泌到氣道的CC16通過(guò)絲氨酸和硫醇結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)，與氣道纖毛上皮細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)合，穩(wěn)定纖毛細(xì)胞的代謝，維持其凈化呼吸道的功能。

CC16參與慢性氣道炎癥性疾病的細(xì)胞和分子機(jī)制

CC16對(duì)炎性細(xì)胞的抑制作用 慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）的發(fā)生和慢性氣道炎癥有關(guān)，這一過(guò)程涉及多種細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等。上皮細(xì)胞被香煙煙霧（cigarette smoking，CS）和其他吸入刺激物（如燃料顆粒等）激活，這些吸入物中的脂多糖類（lipopolysaccharide，LPS）可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6和IL-8。這些炎癥介質(zhì)介導(dǎo)炎性細(xì)胞活化并增強(qiáng)其趨化能力，從而引起氣道慢性炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CS刺激，人類支氣管上皮細(xì)胞IL-8的釋放增加，中性粒細(xì)胞的趨化活性增強(qiáng)，而加入CC16后IL-8水平降低，中性粒細(xì)胞數(shù)量和趨化能力均有所下降，并且這種效應(yīng)與C-X-C基序趨化因子受體1/2（C-X-C motif chemokine receptor 1/2，CXCR1/2）拮 抗 劑 相 似，CXCR1通過(guò)與IL-8結(jié)合發(fā)揮促炎效應(yīng)，因此CC16可能與CXCR1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合從而發(fā)揮抗炎作用［4］。C-X-C基序趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL 1）在COPD發(fā)病機(jī)制中起重要作用，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在CS刺激下釋放CXCL 1，它通過(guò)NF-κB和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，MAPK p38）信號(hào)通路發(fā)揮促炎作用，促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥的發(fā)生［5］。研究發(fā)現(xiàn)，CC16基因缺陷小鼠可出現(xiàn)類似COPD的慢性氣道炎癥的表現(xiàn)，其CXCL 1水平增加導(dǎo)致小氣道周圍的嚴(yán)重炎癥，最終導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)的破壞［6］，提示CC16可能通過(guò)抑制CXCL 1而達(dá)到減弱小氣道周圍炎癥的作用。CC16能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞CD62L的表達(dá)抑制中性粒細(xì)胞的遷移［7］。這些結(jié)果表明，CC16通過(guò)與中性粒細(xì)胞表面配體直接或間接作用影響趨化過(guò)程。

在肺部創(chuàng)傷小鼠模型中，CC16抑制炎癥性單核細(xì)胞的數(shù)量和和遷移，體外實(shí)驗(yàn)證明CC16抑制單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)。去除CC16后，肺部的巨噬細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)化，說(shuō)明肺部巨噬細(xì)胞的促炎和抑炎特性與CC16密切相關(guān)［8］。一些實(shí)驗(yàn)提示CC16可以通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞行為減輕炎癥反應(yīng)［9-10］：CC16缺失導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A 1（annexin A 1，ANXA 1）翻譯后修飾的改變，LPS促進(jìn)CC16基因缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞TNF-α與細(xì)胞表面toll樣 受 體-4（cell surface toll-like receptor-4，TLR-4）表達(dá)。這些變化可能與CC16的旁分泌信號(hào)機(jī)制有關(guān)，了解巨噬細(xì)胞與CC16之間的相互作用可能為治療慢性氣道疾病提供新的途徑。

CC16對(duì)氣道上皮細(xì)胞的作用 小氣道纖維化是COPD氣道阻塞的重要原因，這一過(guò)程和氣道上皮細(xì)胞分泌促炎因子密切相關(guān)。黏蛋白5AC（mucin5AC，MUC5AC）和IL-8是氣道上皮細(xì)胞分泌的參與COPD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵促炎因子，可通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signalregulated kinase1/2，ERK1/2）或磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號(hào)通路激活NF-κB，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究證實(shí)，CC16可抑制暴露于LPS的氣道上皮細(xì)胞MUC5AC和IL-8的mRNA的表達(dá)［11］，重組CC16可明顯抑制COPD患者氣道上皮細(xì)胞的IL-8分泌［12］。給予CC16能減輕CS暴露小鼠的小氣道纖維化，推測(cè)機(jī)制可能為CC16可降低CS暴露小鼠肺中TGF-β水平，從而降低TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞外膠原沉積［13］。CC16通過(guò)降低PLA 2的活性抑制成纖維細(xì)胞的遷移［14］。這些結(jié)果結(jié)果表明CC16在氣道上皮細(xì)胞分泌促炎因子和小氣道纖維化的過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。

club細(xì)胞是支氣管上皮細(xì)胞中重要的祖細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，CC16可保護(hù)club細(xì)胞，穩(wěn)定氣道細(xì)胞內(nèi)源性CC16的產(chǎn)生，表現(xiàn)出對(duì)氣道上皮細(xì)胞的保護(hù)作用［15］。在肺部炎癥性疾病中，肺組織結(jié)構(gòu)主要受基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）等蛋白酶活性的破壞，MMP-9基因啟動(dòng)子含有一個(gè)高度保守的基序，當(dāng)NF-κB p65結(jié)合到該元件后可激活該促炎通路。研究證實(shí)，CC16可通過(guò)阻斷NF-κB信號(hào)通路，從而抑制氣道上皮細(xì)胞MMP-9的表達(dá)［16］。不可逆氣流受限是COPD的特征性表現(xiàn)，這可能和氣道重塑、管腔狹窄有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，club細(xì)胞衰竭會(huì)導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞減少、細(xì)支氣管周圍的纖維化及分泌CC16能力降低。抑制小鼠CC16分泌的同時(shí)加速了氣道慢性鱗狀上皮化生和支氣管周圍纖維化，氣道上皮細(xì)胞增殖能力受損［17］。這些結(jié)果說(shuō)明CC16能夠延緩慢性氣道疾病進(jìn)展，在疾病發(fā)展過(guò)程中起重要的保護(hù)作用。

CC16發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制 NF-κB信號(hào)通路在氣道疾病的炎癥過(guò)程中起著重要作用，可調(diào)節(jié)許多與過(guò)敏性和炎癥性氣道疾病相關(guān)的促炎基因的轉(zhuǎn)錄，如IL-8、嗜酸細(xì)胞趨化因子和COX-2等。氣道吸入的有害物質(zhì)（如LPS）通過(guò)與TLR4結(jié)合并激活NF-κB、MAPK等信號(hào)通路，激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，引起促炎反應(yīng)。NF-κB通路的活性受到抑制蛋白IkBα的嚴(yán)格控制，細(xì)胞被激活后，IKKa/b磷酸化，導(dǎo)致IkBα磷酸化，磷酸化IkBα隨后泛素化和降解，暴露NF-κB p65/p50亞基的核定位序列，并允許p65/p50亞基進(jìn)入細(xì)胞核，從而促進(jìn)DNA結(jié)合和NF-κB基序下游基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。重組CC16通過(guò)抑制p65亞基Ser276處的磷酸化，抑制NF-κB/p65亞基的核移位，從而影響炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，改善COPD癥狀［18］。

NLRP3炎癥小體是一種多蛋白信號(hào)復(fù)合物，參與COPD進(jìn)展，可被病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）和損 傷相關(guān)的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）這兩種信號(hào)通路激活，促進(jìn)半胱氨酸天冬氨酸酶產(chǎn)生，將IL-1β和IL-18前體裂解為活性成熟肽，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［19］。MAPK是細(xì)胞信號(hào)通路的重要組成部分，可將細(xì)胞表面的受體信號(hào)傳遞給細(xì)胞核中的DNA。p38 MAPK和ERK是MAPKs的兩個(gè)重要組件，阻斷p38 MAPK信號(hào)通路可以抑制巨噬細(xì)胞的焦亡，減少急性肺損傷時(shí)炎癥因子的釋放，如TNF-α、IL-6、IL-8等。在膿毒癥小鼠模型中，重組CC16通過(guò)p38 MAPK和ERK信號(hào)通路抑制大鼠中NLRP3/caspase 1誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，這提示在氣道炎癥過(guò)程中，CC16可能通過(guò)這兩種途徑抑制NLRP3炎癥小體，從而發(fā)揮抗炎作用［20］。

PLA 2是花生四烯酸生成中的限速酶，與前列腺素和白三烯合成有關(guān)。CC16能夠抑制多種PLA 2，包括1b型sPLA 2、2a型sPLA 2和Ⅳ型cPLA 2。鈣和磷脂酰膽堿作為sPLA 2的共同因子或底物，CC16可與其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制酶促反應(yīng)，還可干擾sPLA 2與水-脂界面的相互作用，這是該酶最初激活的必要步驟［2］。最近一項(xiàng)關(guān)于CC16在氣道炎癥中作用的研究證明，CC16能夠通過(guò)抑制cPLA 2/cox2通路減輕肺部氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性［21］。除了上述3種機(jī)制外，CC16還能通過(guò)其他途徑干預(yù)氧化應(yīng)激而發(fā)揮抗炎的作用，如抑制肺部組織中性粒細(xì)胞的數(shù)量和MPO的活性［22］。

CC16的臨床應(yīng)用前景

CC16是潛在的慢性氣道疾病的生物標(biāo)志物分泌球蛋白家族1A成員1（secretoglobin family 1A member 1，SCGB1A 1）是多種肺部疾?。ㄌ貏e是哮喘、COPD和肺癌病理進(jìn)展）中的重要蛋白［23］。急性肺損傷引起的血?dú)馄琳蠐p傷可導(dǎo)致血清CC16短暫升高，而慢性肺損傷（如COPD）引起的氣道上皮損傷可減少club細(xì)胞數(shù)量，從而導(dǎo)致CC16持續(xù)下降，這提示CC16可能是COPD的一種潛在生物標(biāo)志物［24］。通過(guò)孟德爾隨機(jī)化研究發(fā)現(xiàn)，肺組織基因中存在多個(gè)位點(diǎn)影響CC16的表達(dá)，血清CC16對(duì)COPD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及其進(jìn)展具有潛在的因果效應(yīng)［25］。在吸煙者中，CC16表達(dá)和FEV 1下降有顯著關(guān)聯(lián)，即CC16表達(dá)越低，F(xiàn)EV 1/FVC比值越低。在香煙煙霧提取物的刺激下，支氣管上皮細(xì)胞中CC16相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)均持續(xù)減少，提示血清CC16水平降低可能是早期預(yù)測(cè)吸煙者肺功能下降的敏感指標(biāo)［26］。最近的一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，血清CC16濃度降低與慢性阻塞性肺疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，穩(wěn)定期COPD患者血清CC16水平較健康對(duì)照組降低，GOLD 3～4級(jí)的COPD患者血清CC16濃度相比GOLD 1～2級(jí)的COPD患者較低。這表明血清CC16濃度能反映COPD的嚴(yán)重程度［27］。隊(duì)列研究表明，CC16與肺功能缺陷有關(guān)，循環(huán)中CC16水平越低，肺功能越差，氣道反應(yīng)性越強(qiáng)。在CC16缺陷小鼠中也觀察到相似的結(jié)果，并且這一過(guò)程與炎癥反應(yīng)和黏蛋白的產(chǎn)生無(wú)關(guān)［28］。在慢性肺部炎性疾病的進(jìn)展過(guò)程中，血清CC16濃度變化可能是預(yù)測(cè)肺功能和疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)志物之一，在早期慢性氣道疾病的診斷方面有應(yīng)用潛力。

尿CC16可能是嬰幼兒下呼吸道感染后預(yù)測(cè)兒童喘息性疾病發(fā)展的一個(gè)生物標(biāo)志物。一項(xiàng)隊(duì)列研究表明，嬰兒下呼吸道感染時(shí)尿CC16水平與1年內(nèi)發(fā)展為哮喘的概率成反比［29］，這可能是因?yàn)楹粑栏腥竞?，小氣道炎癥損傷遠(yuǎn)端氣道club細(xì)胞，從而導(dǎo)致CC16產(chǎn)生減少，抗炎、抗氧化、保護(hù)氣道上皮細(xì)胞作用隨之減弱，增加哮喘發(fā)作可能。另外，也有疾病急性期血漿、尿中CC16濃度升高的報(bào)道。過(guò)敏性哮喘患者吸入過(guò)敏原后血漿CC16濃度增加，其原因可能為氣血屏障滲漏或暴露于過(guò)敏原后急性期club細(xì)胞增殖［30］。臨床研究表明，嬰兒感染患急性細(xì)支氣管炎時(shí)尿CC16水平升高，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。以上結(jié)果提示尿CC16可能是病毒感染后急性毛細(xì)支氣管炎的潛在生物標(biāo)志物，這種非侵入性的檢測(cè)方法在嬰兒群體中最為有效［31］。CC16可能作為生物標(biāo)記物反映嬰幼兒呼吸道感染嚴(yán)重程度，同時(shí)具有預(yù)測(cè)哮喘發(fā)展的潛力。

關(guān)于哮喘COPD重疊綜合征的研究表明，哮喘患者血清CC16水平明顯低于單一哮喘或COPD患者。隨著時(shí)間推移，CC16水平降低與肺功能加速下降以及COPD的嚴(yán)重程度和進(jìn)展相關(guān)。CC16與2年內(nèi)急性加重頻率呈負(fù)相關(guān)，提示CC16可能是影響慢性氣道炎癥疾病預(yù)后的因素之一［32］。

CC16可能是治療慢性氣道疾病的新靶點(diǎn)

CC16具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎能力，與慢性氣道炎癥性疾病密切相關(guān)，這提示CC16作為治療慢性氣道疾病靶點(diǎn)的可能性。在Laucho-Contreras等［13］關(guān)于CC16與COPD的研究中，暴露于CS的CC16基因敲除小鼠肺部炎癥、肺氣腫、氣道重塑的進(jìn)展與野生型小鼠相比均較快，同時(shí)NF-κB通路表達(dá)增強(qiáng)。將CC16基因?qū)牖蚯贸∈篌w內(nèi)后，腺病毒介導(dǎo)的CC16在小鼠體內(nèi)的過(guò)表達(dá)減輕了其肺部炎癥，這種作用與肺中NF-κB通路的激活減少有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)CC16基因敲除小鼠和野生型小鼠相比，表現(xiàn)出與COPD相似的肺老化加速的特征，肺巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，肺間質(zhì)細(xì)胞凋亡增加，氧化應(yīng)激水平增高，NF-κB通路表達(dá)增強(qiáng)［33］。這些研究表明，CC16可以通過(guò)抑制肺部炎癥發(fā)揮對(duì)肺部的保護(hù)作用，提高CC16表達(dá)水平可能是一種潛在的COPD治療方法。研究表明，重組CC16能夠通過(guò)NF-κB途徑下調(diào)促炎因子，減輕COPD癥狀，CC16在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)以及肺部細(xì)胞因子激活方面起重要作用，提示這可能是一種治療COPD的新手段［34］。

研究發(fā)現(xiàn)，和健康人相比，哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液、痰液和血清中CC16明顯減少［35］。在哮喘小鼠模型中觀察到CC16表達(dá)下調(diào)與哮喘進(jìn)展相關(guān)，CC16基因敲除小鼠細(xì)胞經(jīng)CC16處理后，和哮喘相關(guān)的Th2細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5和IL-13）表達(dá)受到抑制，而不影響Th1細(xì)胞因子水平。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)FOXA 2是調(diào)控CC16表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，叉頭盒蛋白A 2（forkhead box protein A 2，F(xiàn)OXA 2）在促進(jìn)CC16相關(guān)基因表達(dá)的同時(shí)，還能夠抑制黏蛋白基因MUC5AC的表達(dá)。通過(guò)增強(qiáng)FOXA 2的活性間接調(diào)節(jié)CC16水平可能是治療哮喘的一種新方法。

肺泡巨噬細(xì)胞吞噬、免疫、分泌作用都十分活躍，是肺部免疫系統(tǒng)的第一道防線。研究發(fā)現(xiàn)，CC16基因敲除小鼠的免疫系統(tǒng)功能過(guò)早減弱，外源性補(bǔ)充重組CC16顯著抑制巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子，包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等。通過(guò)基因治療或重組蛋白的氣道遞送誘導(dǎo)肺過(guò)度表達(dá)SCGB1A 1，可能有助于抑制肺部炎性疾病中炎癥和細(xì)胞因子的激增［36］。

結(jié)語(yǔ)CC16在COPD等氣道疾病發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用，然而CC16是否能作為臨床慢性氣道疾病的生物標(biāo)記物，仍有待在各種疾病（如COPD、哮喘、慢性支氣管炎、囊性肺纖維化）的人群中進(jìn)行驗(yàn)證。雖然將重組CC16輸送到CC16缺乏的COPD肺部是一種替代方法，但其安全性和有效性尚待進(jìn)一步研究。另一方面，還可考慮通過(guò)激活CC16轉(zhuǎn)錄或關(guān)閉CC16的表觀基因沉默，開發(fā)可利用的小分子來(lái)促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞表達(dá)CC16。加深對(duì)CC16作用機(jī)制的了解、識(shí)別其潛在的受體和信號(hào)通路、發(fā)現(xiàn)抗炎作用之外的其他作用有助于開發(fā)治療氣道疾病的新靶點(diǎn)和新策略。

作者貢獻(xiàn)聲明崔博 文獻(xiàn)檢索，綜述構(gòu)思和撰寫。馬圓 文獻(xiàn)檢索，綜述修訂。陳智鴻 綜述指導(dǎo)和審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。