溶瘤病毒治療肝癌的研究進(jìn)展

龔濤，琚姝，劉建飛

上海三維生物技術(shù)有限公司，上海 201206

肝癌是中國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其預(yù)后差、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高，患者5 年生存率僅為18%[1-2]。目前針對(duì)肝癌的最有效治療手段為手術(shù)治療，早期肝癌可通過(guò)手術(shù)切除和消融技術(shù)來(lái)進(jìn)行治療。然而由于肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床早期癥狀不明顯，患者就診時(shí)通常已屬于中晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，因此肝癌的臨床主要治療手段通常采用系統(tǒng)聯(lián)合局部（如介入治療、放療等）的綜合治療方案，但由于肝癌對(duì)傳統(tǒng)的化療有很高的耐藥性，且放療對(duì)肝臟不良反應(yīng)大，因此尋求有效的肝癌治療手段顯得至關(guān)重要[3-4]。近年來(lái)，免疫治療成為繼手術(shù)、放療、化療和靶向治療之后的一種新型腫瘤治療方法，其通過(guò)引導(dǎo)患者自身免疫系統(tǒng)，激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，阻止腫瘤免疫逃逸，達(dá)到控制和殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[5]。針對(duì)腫瘤治療的免疫治療包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑、過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療、腫瘤疫苗、溶瘤病毒等[6]。隨著免疫治療的迅速發(fā)展，溶瘤病毒作為一種新的免疫治療手段，已顯現(xiàn)出較好的治療效果，成為了肝癌治療的研究熱點(diǎn)之一[7]。本文就溶瘤病毒的作用機(jī)制及其在肝癌治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 溶瘤病毒的定義及其抗腫瘤作用機(jī)制

溶瘤病毒是具有自我增殖能力的一類特異性腫瘤殺傷型病毒，其能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制并造成腫瘤細(xì)胞裂解，同時(shí)不影響正常細(xì)胞與組織。

溶瘤病毒的作用機(jī)制主要有兩類：第一類為病毒直接介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，溶瘤病毒可特異性感染腫瘤部位并自我增殖，在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)擴(kuò)增大量子代病毒裂解腫瘤細(xì)胞，從而直接殺傷腫瘤細(xì)胞。第二類為激活免疫系統(tǒng)，通過(guò)改變腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的免疫原性，或釋放腫瘤相關(guān)抗原或炎癥因子等多種途徑，誘導(dǎo)自身免疫系統(tǒng)針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，解除腫瘤部位的免疫抑制狀態(tài)[8-9]。此外，溶瘤病毒也可以感染腫瘤部位血管，破壞腫瘤血管，抑制腫瘤獲取營(yíng)養(yǎng)，從而殺死腫瘤細(xì)胞[10]。

2 溶瘤病毒治療肝癌的研究進(jìn)展

溶瘤病毒具有直接裂解腫瘤細(xì)胞、誘發(fā)并增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的特異性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物效果等多種作用，但不影響正常細(xì)胞生長(zhǎng)，其特異性強(qiáng)、不良反應(yīng)小，因此通過(guò)基因修飾或改造的溶瘤病毒在肝癌治療領(lǐng)域備受關(guān)注。目前用于肝癌治療的溶瘤病毒主要有腺病毒、單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）等[11]。

2.1 溶瘤腺病毒

目前全球已上市兩款腺病毒抗腫瘤藥物，且有20 多種腺病毒相關(guān)藥物處于臨床試驗(yàn)階段。腺病毒的主鏈可進(jìn)行靈活的基因修飾，由于其高度可定制性，腺病毒成為了最重要的溶瘤病毒之一，在腫瘤治療中常用的腺病毒為致病力弱的人血清2型或5 型腺病毒[12]。

ONYX-015 是一種5 型腺病毒，刪除了E1B-55KD 基因，使其能在抑癌基因p53 缺失細(xì)胞中優(yōu)先復(fù)制[13]。在其Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，19 例肝膽惡性腫瘤患者接受了病灶內(nèi)ONYX-015 治療，ONYX-015病灶內(nèi)注射治療肝膽腫瘤患者安全且耐受性良好，部分患者有抗腫瘤作用證據(jù)。重組人5 型腺病毒H101 與ONYX-015 非常相似[14]，但在其E3 基因中有一個(gè)額外的缺失，刪除了E1B-55KD 和E3 部分基因片段，使其在精準(zhǔn)溶瘤的同時(shí)實(shí)現(xiàn)全身免疫，是全球首個(gè)上市的溶瘤腺病毒抗腫瘤藥物。重組人5 型腺病毒H101 可選擇性感染p53 功能缺失的腫瘤細(xì)胞，而正常細(xì)胞不受影響，在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)p53 功能缺失的肝癌細(xì)胞具有抗腫瘤活性。體外研究表明，重組人5 型腺病毒H101 對(duì)HepG2細(xì)胞有顯著抑制增殖作用。在不能切除的肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者中，經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞化療（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）聯(lián)合重組人5 型腺病毒H101 治療與單獨(dú)采用TACE 治療相比，改善了總生存率、無(wú)進(jìn)展生存期和完全緩解率。臨床治療中顯示，重組人5 型腺病毒H101 聯(lián)合TACE 治療可使腫瘤降期，從而達(dá)到手術(shù)切除的目的[15]。針對(duì)TACE 治療后部分耐缺氧及化療耐藥的腫瘤細(xì)胞，為預(yù)防HCC復(fù)發(fā)，Zhang 等[16]構(gòu)建了一種缺氧復(fù)制型溶瘤腺病毒，克服栓塞后缺氧的腫瘤微環(huán)境，可特異性地靶向存活的肝癌細(xì)胞。

2.2 HSV

HSV 是嗜神經(jīng)性的雙鏈DNA 包膜病毒，可分為Ⅰ型HSV（HSV-1）和Ⅱ型HSV（HSV-2）兩種血清型。HSV-1 具有宿主范圍廣泛、能夠攜帶多種外源DNA 等優(yōu)勢(shì)，因此目前處于臨床試驗(yàn)的溶瘤HSV 大部分由HSV-1 改造而來(lái)。

在美國(guó)獲批的第二代溶瘤HSV-1 T-VEC[17]便是由HSV-1 改造而來(lái)的，敲除了c34.5 和a47 基因后將人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因插入缺失的c34.5 位點(diǎn)。一項(xiàng)T-VEC 與帕博利珠單抗（pembrolizumab）的Ⅰb/Ⅱ期臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中，Ⅰb 期主要研究T-VEC 單藥肝內(nèi)注射治療HCC 以及T-VEC 與帕博利珠單抗全身靜脈給藥聯(lián)合治療肝轉(zhuǎn)移的安全性，Ⅱ期主要研究T-VEC 與帕博利珠單抗聯(lián)合給藥治療晚期實(shí)體瘤的安全性及有效性（NCT02509507）。第三代溶瘤HSV-1 T-01[18]在第二代溶瘤HSV 的基礎(chǔ)上繼續(xù)改進(jìn)，刪除了病毒蛋白感染細(xì)胞多肽6（infected cell polypeptides 6，ICP6），由β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，LacZ）基因取代ICP6 基因，因此也比兩個(gè)突變的病毒（如T-VEC）更安全。T-01 可抑制人肝癌細(xì)胞系和肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系腫瘤的生長(zhǎng)，結(jié)果表明第三代溶瘤HSV-1 可作為HCC 患者的新型治療方法?；谶@些進(jìn)展，設(shè)計(jì)了一種基于HSV-1 的溶瘤載體Ld0-GFP[19]，該載體來(lái)源于溶瘤ICP0 缺失病毒（d0-GFP），具有融合表型，是一種針對(duì)HCC 以及其他類型腫瘤細(xì)胞的新型殺手。與d0-GFP 相比，Ld0-GFP 在體內(nèi)外均表現(xiàn)出優(yōu)越的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，靶向廣譜HCC 細(xì)胞，具有更好的安全性。

2.3 溶瘤牛痘病毒

Pexa-Vec（JX-594）是一種具備復(fù)制能力、轉(zhuǎn)基因表達(dá)的免疫治療性溶瘤牛痘病毒，可破壞病毒胸苷激酶基因，并表達(dá)人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和β-半乳糖苷酶基因[20]。Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明，JX-594 治療原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌具有良好的耐受性。在JX-594 復(fù)制、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）表達(dá)和全身播散的背景下，其安全性可接受，并對(duì)幾種難治性腫瘤具有抗腫瘤作用[21]。在隨機(jī)的Ⅱb 期臨床試驗(yàn)中，研究索拉非尼治療失敗后接受JX-594 治療的療效和安全性。研究存在顯著的局限性，接受JX-594 治療的患者總生存率沒有改善。然而，研究也取得了一些成果，通過(guò)β-半乳糖苷酶的測(cè)量確認(rèn)了病毒復(fù)制，并通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)了T 細(xì)胞對(duì)腫瘤特異性抗原[如甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、黑色素瘤相關(guān)抗原（melanoma antigen gene，MAGE）-A1/A3/A4]生存素的應(yīng)答[22]。PHOCUS 是一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)（NCT02562755），對(duì)比研究了在既往未接受過(guò)全身治療的晚期HCC 患者中，采用Pexa-Vec 加索拉非尼聯(lián)合用藥和索拉非尼單藥治療的療效，但在進(jìn)行中期分析后，結(jié)果顯示臨床試驗(yàn)不太可能達(dá)到主要終點(diǎn)，因此終止了該臨床試驗(yàn)[23]。

3 溶瘤病毒聯(lián)合其他治療手段治療肝癌的研究進(jìn)展

盡管一些溶瘤病毒治療腫瘤的臨床前研究得到極大的關(guān)注，但在臨床試驗(yàn)中，溶瘤病毒的治療效果往往達(dá)不到基于臨床前模型的預(yù)期療效，但與其他治療手段聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)出了很強(qiáng)的應(yīng)用潛力，因此通過(guò)其他治療手段與溶瘤病毒聯(lián)合使用或許可能是優(yōu)化其殺傷腫瘤細(xì)胞作用的有效策略。

3.1 溶瘤病毒聯(lián)合化療藥物治療肝癌

Xiao 等[24]在之前構(gòu)建的重組腺病毒CD55-TRAIL-IETD-MnSOD（CD55-TMn）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CD55-TMn 與多柔比星聯(lián)合使用可以通過(guò)協(xié)同作用增強(qiáng)CD55-TMn 在體外和體內(nèi)的抗腫瘤作用。一項(xiàng)臨床研究也顯示，對(duì)于晚期肝癌患者，在化療基礎(chǔ)上聯(lián)合H101 瘤內(nèi)注射可提高客觀有效率和生存率，且耐受性良好[25]。

3.2 溶瘤病毒聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療肝癌

治療腫瘤的方法之一是使用針對(duì)免疫檢查點(diǎn)蛋白的抑制劑，如程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）。

王立朋等[26]將PD-1 抗體的重鏈和輕鏈插入流感病毒PR8 的聚合酶堿性蛋白1（polymerase basic protein 1，PB1）基因片段和聚合酶酸性蛋白（polymerase acid protein，PA）基因片段中得到重組流感病毒株rFlu-aPD1，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示具有良好的靶向殺傷肝癌細(xì)胞的效果。在另一項(xiàng)研究中，將CTLA4 插入流感病毒PR8 中得到rFlu-CTLA4，在皮下小鼠肝癌模型中，與注射PR8 病毒相比，瘤內(nèi)注射rFlu-CTLA4 可抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了小鼠的總生存期[27]。這些結(jié)果激發(fā)了進(jìn)一步探索這種溶瘤病毒聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的潛在用途。一項(xiàng)關(guān)于重組人5 型腺病毒和PD-1 抗體聯(lián)合治療的研究結(jié)果顯示，2 例患者在經(jīng)射頻消融預(yù)處理后聯(lián)合重組人5型腺病毒和PD-1治療獲得了完全緩解，是治療晚期HCC 的有效方法[28]。一項(xiàng)T-VEC 與帕博利珠單抗的Ⅰb 期臨床試驗(yàn)結(jié)果也顯示，肝內(nèi)注射T-VEC 聯(lián)合靜脈注射帕博利珠單抗治療肝癌或肝轉(zhuǎn)移患者是安全可行的[29]，值得進(jìn)一步研究。

3.3 溶瘤病毒聯(lián)合靶向藥物治療肝癌

索拉非尼是一種口服多靶點(diǎn)多激酶抑制劑，具有雙重抗腫瘤作用，主要用于治療晚期肝癌以及晚期腎癌，但其單用療效有限且不良反應(yīng)發(fā)生率高。李璐璐等[30]體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼聯(lián)合重組人5 型腺病毒注射液H101 對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用明顯優(yōu)于單用索拉非尼，且在一定濃度范圍內(nèi)兩藥聯(lián)用表現(xiàn)出協(xié)同作用。莊建發(fā)等[31]也對(duì)索拉非尼聯(lián)合重組人5 型腺病毒H101 用藥進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)用抑制HepG2 細(xì)胞增殖的主要機(jī)制為對(duì)RAF/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起到阻斷作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并有效抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。VSVΔ51 是水皰性口炎病毒的新型突變體，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，具有DNA-PK 抑制能力的小分子藥物M3814 可以顯著提高VSVΔ51 的溶瘤活性，在外周實(shí)體瘤模型中取得了強(qiáng)大的抗腫瘤效果[32]。這種增效作用是通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的，該研究或許可以為肝癌的治療提供一種新的思路。

3.4 溶瘤病毒協(xié)同過(guò)繼性細(xì)胞療法（adoptive cell therapy，ACT）治療肝癌

ACT是一種將自體或異體具有免疫活性的細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增后再輸至患者體內(nèi)的治療方法[33]，從而達(dá)到抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cell，CIK）體外增殖能力強(qiáng)，安全性高，自身具有腫瘤殺傷能力，又不具備抗原呈遞能力。溶瘤病毒在治療實(shí)體瘤時(shí)采用靜脈注射的給藥方式往往會(huì)導(dǎo)致病毒被免疫系統(tǒng)清除，因此，應(yīng)用CIK 細(xì)胞作為運(yùn)載溶瘤病毒的載體，可以攜帶溶瘤病毒，高效感染腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮CIK 細(xì)胞和病毒的聯(lián)合殺瘤作用。有研究表明，構(gòu)建攜帶抗p21 Ras scFv 的重組溶瘤腺病毒KGHV500，并利用CIK 細(xì)胞遞送KGHV500，其抗腫瘤療效遠(yuǎn)優(yōu)于單獨(dú)使用CIK 細(xì)胞或KGHV500，開發(fā)了一種治療RAS 驅(qū)動(dòng)的肝癌的新策略[34]。

4 小結(jié)及展望

溶瘤病毒具有在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞的獨(dú)特能力，還能激活自身免疫系統(tǒng)，間接誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)（包括破壞腫瘤血管）并增強(qiáng)腫瘤免疫治療。近年來(lái)，作為一種有潛力的抗腫瘤藥物，溶瘤病毒的研究取得了重要進(jìn)展，但溶瘤病毒的應(yīng)用仍存在一定的局限性。溶瘤病毒進(jìn)入機(jī)體后易被清除，從而導(dǎo)致靶向腫瘤部位的抑癌病毒量不足，難以發(fā)揮出理想的抑癌作用；利用載體裝載病毒雖能提高溶瘤病毒的靶向性，但所用載體的安全性及有效性也需進(jìn)一步研究；同時(shí)溶瘤病毒進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，出現(xiàn)諸如發(fā)熱、流感樣癥狀等常見不良反應(yīng)。因此，阻礙溶瘤病毒療法發(fā)展的主要因素是腫瘤微環(huán)境中的系統(tǒng)和物理屏障。針對(duì)溶瘤病毒療法的上述局限性及不良反應(yīng)，如下問(wèn)題亟須進(jìn)一步研究解決：①降低病毒毒性，提高安全性，確保病毒能夠在不感染健康細(xì)胞的情況下最大限度地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，盡量減少不良反應(yīng)。②提高溶瘤病毒靶向腫瘤細(xì)胞的能力，構(gòu)建安全有效的載體平臺(tái)，防止病毒被人體強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)消滅，以提高治療效果。③溶瘤病毒注射的劑量較大，溶瘤病毒產(chǎn)品目前最大的技術(shù)難點(diǎn)在于如何大規(guī)模制備以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)應(yīng)用。

綜上所述，由于溶瘤病毒的獨(dú)特作用機(jī)制，溶瘤病毒在大量的臨床前研究中展現(xiàn)出了抗腫瘤的顯著療效及安全性，具有良好的臨床應(yīng)用前景。但是由于肝癌等實(shí)體瘤生物學(xué)特性更為復(fù)雜，臨床試驗(yàn)中溶瘤病毒單藥治療肝癌的研究仍未取得突破性進(jìn)展。溶瘤病毒聯(lián)合其他治療手段治療肝癌具有良好的發(fā)展前景，已有臨床試驗(yàn)開始對(duì)聯(lián)合治療手段展開探索，且取得了不錯(cuò)的結(jié)果，但目前仍未大范圍應(yīng)用于臨床，因此需要更多、更大樣本量數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。