NLRP3炎癥小體在熱應(yīng)激損傷中的作用研究

楊麗麗 李 斌 倪海東

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院兒科 南通 226001）

小兒熱性驚厥（Febrile Seizures，F(xiàn)S）主要是因為發(fā)熱所引起的，對于6個月-5歲的幼兒有著較高的發(fā)病率[1]。尤其是在我國的南方地區(qū)，發(fā)病率達(dá)到了16%。關(guān)于FS的發(fā)病機(jī)制，主要是由于異常過度放電引起[2]，所以是難以進(jìn)行預(yù)測的，主要的診斷手段為影像學(xué)、腦電波記錄、腰椎穿刺等等，這些都是屬于有創(chuàng)診斷，會對患兒的身體造成較大傷害。由于缺少FS治療手段，所以在臨床上往往是通過藥物緩解癥狀，但是具有一定的副作用[3]。炎癥小體是胞漿當(dāng)中的多蛋白復(fù)合物，可以對受體進(jìn)行識別以及危險信號傳導(dǎo)，激活下游級聯(lián)反應(yīng)。相關(guān)研究表明，NLRP3炎癥小體在很多疾病當(dāng)中都會產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[4]。本文基于此，對NLRP3炎癥小體在熱應(yīng)激損傷中的作用進(jìn)行了研究。研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備

生物超凈臺DMEM培養(yǎng)基（美國Hcyclone），胎牛血清（美國GIBCO），青鏈霉素（美國GIBCO），MTT（美國GIBCO），DMSO（美國Sigma公司），蘇木精-伊紅染液（上海舜田生物有限公司）[5]。

1.2 方法

選擇2019年5月1日-2021年11月1日在南通大學(xué)附屬醫(yī)院就診的90例6月-6歲FS患兒作為熱性驚厥組(FS組)，其中單純性熱性驚厥患兒（SPS）52例，復(fù)雜性熱性驚厥患兒（CFS）38例。選擇同一時期到我院進(jìn)行健康體檢的25例健康兒童作為對照組。通過PCR的方法對外周血NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測，通過ELISA法檢測患者外周血IL-1β、IL-6， TNF-α、NSE表達(dá)水平進(jìn)行檢測。納入標(biāo)準(zhǔn)：FS診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)第八版《諸福棠實用兒科學(xué)》，并最終確診原發(fā)病為急性上呼吸道感染[6]。CFS入選標(biāo)準(zhǔn):長時間的驚厥發(fā)作，持續(xù)時間≥15min；叢集式發(fā)作，24h內(nèi)反復(fù)發(fā)作≥2次；局灶性發(fā)作，且熱退1周后有腦電圖異常；反復(fù)頻繁的驚厥發(fā)作，累計發(fā)作總次數(shù)≥5次。具備上述1條即可診斷為CFS。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)有原發(fā)性的顱腦損傷患兒；2)有顱內(nèi)感染的患兒；3)CT/MRI檢查有異常的患兒；4)確診癲癇的患兒；5)維生素D缺乏低Ca性抽搐；6)其他電解質(zhì)紊亂引起的抽搐；7)代謝性疾病引起的抽搐；8)出生為早產(chǎn)兒或過期產(chǎn)兒[7]。

建立FS動物模型，選擇20只SPF級別周齡2周的正常SD大鼠作為研究對象，通過熱水浴誘導(dǎo)驚厥的方式進(jìn)行建模，F(xiàn)S5級行為評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。共分為五級，癥狀從輕到重[8]。使用RIPA裂解液對蛋白進(jìn)行裂解，溫度為4℃，在12000g下離心15min，靜置10min后取上清液，按照每孔30ug進(jìn)行蛋白分離。最后，為了探討NLRP3炎癥小體抑制劑在反復(fù)FS當(dāng)中的保護(hù)作用，將大鼠分為FS組（n=10）、FS+NLRP3炎癥小體抑制劑組（n=10），在熱水浴槽當(dāng)中進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察驚厥行為的特征，若出現(xiàn)跌倒或者痙攣，將其當(dāng)做第一次的驚厥發(fā)作，并講放入熱水浴槽到驚厥發(fā)作的時間進(jìn)行記錄，發(fā)作驚厥后放入常溫平板中進(jìn)行休息，休息時間5min，隨后重新放入熱水浴槽，若再次出現(xiàn)驚厥行為，將其當(dāng)做第二個發(fā)作。實驗時長為55min，若沒有發(fā)生驚厥性為，則當(dāng)做未出現(xiàn)驚厥發(fā)作。誘發(fā)驚厥 2次/d，共 10次。比較兩組潛時。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒外周血相關(guān)數(shù)據(jù)變化

將兩組患兒的外周血相關(guān)數(shù)據(jù)變化進(jìn)行記錄。研究結(jié)果表明，F(xiàn)S組患兒的IL-1β、IL-6、NLRP3、TNF-α明顯升高，且相較于正常對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 兩組患兒外周血相關(guān)數(shù)據(jù)變化

2.2 大鼠模型實驗結(jié)果

將大鼠分為FS組和FS+NLRP3炎癥小體抑制劑組，對大鼠進(jìn)行熱水浴模型測試，觀察兩組大鼠的驚厥發(fā)作潛時。研究結(jié)果表明，F(xiàn)S組大鼠的潛時明顯低于FS+NLRP3炎癥小體抑制劑組，且在數(shù)據(jù)的對比中具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），如表2所示。

表2 兩組大鼠驚厥行為潛時對比

2.3 兩組大鼠在不同時間的生存率比較

將兩組大鼠在不用時間內(nèi)的生存率進(jìn)行比較，研究結(jié)果表明，1小時內(nèi)，兩組大鼠的生存率無明顯差異（P＞0.05），在2小時后，兩組大鼠的生存率具有明顯差異，在平均生存時間上也具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 兩組大鼠在不同時間的生存率比較（%）

3 討論

當(dāng)前關(guān)于熱應(yīng)激損傷的發(fā)病機(jī)制還不是很完善，這與兒童神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育功能有著密切的關(guān)系，由于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育功能不完全，導(dǎo)致神經(jīng)元的微環(huán)境受到了影響[9]。相關(guān)研究表明，F(xiàn)S的發(fā)生與呼吸性堿中毒有關(guān)，隨著患兒體溫的升高，會導(dǎo)致機(jī)體通氣過度，提高二氧化碳的濃度，直接引起呼吸性堿中毒[10]。由于高熱所引起的炎癥對幼兒的生活質(zhì)量造成了較大的影響，高熱相關(guān)的因子包括白介素-1β（IL-1β）、白介素-1α（IL-1α）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）等[11]，這些因子的表達(dá)在熱驚厥患者中都有明顯的提高。在某項大鼠模型研究中，缺乏IL-1β受體的大鼠更加耐受熱驚厥，說明IL-1β參與到驚厥的發(fā)生中。隨后對周齡為2周的大鼠注射紅藻氨酸[12]，從而建立熱驚厥模型，結(jié)果表明IL-1β在熱性驚厥中有潛在的發(fā)生作用。NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC、pro-caspase-1所組成[13]，是一種多聚體的蛋白復(fù)合物。在受到高熱的刺激之后，炎癥因子會啟動[14]。細(xì)胞受到高熱影響時，細(xì)胞當(dāng)中的識別受體PRRs（Pattern Recognition Receptors）會與結(jié)合分子ASC、NLRP3、caspase-1組成完整的炎癥小體。NLRP3炎性小體能使磷酸化caspase-1去磷酸化，活化的caspase-1促進(jìn) IL-1β、白介素-18 ( IL-18) 炎性因子前體的成熟，由此可見 NLRP3 炎性小體活化是IL-1β成熟的關(guān)鍵。盡管臨床研究及動物實驗均證實IL-1β在熱性驚厥中表達(dá)上調(diào)，但是目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于NLRP3炎癥小體與小兒熱性驚厥的發(fā)作關(guān)系研究的報道[15]。

本文基于此，對NLRP3炎癥小體在熱應(yīng)激損傷中的作用展開了研究。研究結(jié)果表明，熱性驚厥組患兒，尤其是復(fù)雜性熱性驚厥患兒（CFS）的IL-1β、IL-6、NLRP3、TNF-α有明顯的升高，相較于正常對照組具有統(tǒng)計學(xué)差異。在大鼠模型的研究中，F(xiàn)S組大鼠驚厥潛時明顯低于FS+NLRP3炎癥小體抑制劑組，表明有了抑制劑的加成，大鼠的驚厥潛時增加，驚厥次數(shù)較少。在不同時間內(nèi)大鼠生存率的比較中，1小時內(nèi)兩組大鼠的生存率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，在兩小時后，F(xiàn)S+NLRP3炎癥小體抑制劑組的大鼠潛時明顯高于FS組，且在平均生存時間上高于FS組，具有統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，NLRP3炎癥小體會參與到熱應(yīng)激損傷中，會對NLRP3炎癥小體進(jìn)行抑制，并且提高大鼠的生存時間。可提高患兒的IL-1β、IL-6、NLRP3、TNF-α等相關(guān)指標(biāo)，增加大鼠模型的驚厥潛時，且NLRP3炎癥小體的激活與IL-1β有著密切的關(guān)系。是熱應(yīng)激損傷中非常重要的指標(biāo)之一，需要重視。