多糖鐵復(fù)合物膠囊的溶出度測(cè)定

王耀霞 孔凡強(qiáng) 程宏霞 范前業(yè) 朱斌 丁海燕▲

1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東青島 266003；2.上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，山東青島 266510

鐵是人體中重要的礦物質(zhì)元素之一，其含量在人體中約占0.004%，它參與人體多種生命活動(dòng)，對(duì)機(jī)體的代謝過程發(fā)揮著極其重要的作用，鐵元素缺乏導(dǎo)致的貧血稱之為缺鐵性貧血[1]。世界上25%以上的人群患有貧血癥，而缺鐵性貧血是最常見的貧血癥之一，占貧血癥患者總數(shù)的50%以上[2-3]。其中妊娠期婦女及兒童由于對(duì)營(yíng)養(yǎng)及微量元素需求量大，是缺鐵性貧血的高發(fā)人群[4-5]。

臨床上常用的口服補(bǔ)鐵劑已發(fā)展了三代，第一代是以硫酸亞鐵為代表的無機(jī)亞鐵鹽類；第二代是以富馬酸亞鐵、琥珀酸亞鐵等為代表有機(jī)亞鐵鹽類；第三代是以大分子螯合鐵為代表的新型補(bǔ)鐵劑。第一代和第二代補(bǔ)鐵劑由于其生物利用度較低、易產(chǎn)生較大的胃腸道副作用和細(xì)胞膜損傷，限制了其臨床應(yīng)用；第三代新型補(bǔ)鐵劑雖然可以降低胃腸道副作用，但還存在一些鐵鹽螯合物體內(nèi)生物利用度低，造價(jià)較高等問題[6-9]。目前以多糖鐵復(fù)合物（polysaccharide-iron complex，PIC）為代表的第三代口服補(bǔ)鐵劑，由于具有良好的溶解性及較高的體內(nèi)生物利用度成為近年來研究的熱點(diǎn)[10-11]。PIC 的合成方法以化學(xué)合成法為主[12]，有研究人員采用該方法合成出孔石莼多糖鐵復(fù)合物[13]、滸苔多糖鐵復(fù)合物[14]、當(dāng)歸多糖鐵復(fù)合物[15]等，進(jìn)一步研究也表明PIC 的合成并非簡(jiǎn)單的物理吸附而是穩(wěn)定絡(luò)合反應(yīng)[16]。目前市售的多糖鐵復(fù)合物膠囊，元素鐵含量高達(dá)150 mg/粒，在消化道能以分子形式被吸收。在臨床上，由于其具有良好的有效性和安全性，常用于妊娠期女性鐵缺乏癥和缺鐵性貧血的治療[17-18]。臨床研究數(shù)據(jù)表明，相對(duì)于其他口服鐵劑，多糖鐵復(fù)合物膠囊的胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)發(fā)生率更低[19-22]。

多糖鐵復(fù)合物膠囊雖上市多年，但各國(guó)藥典均未收載該品種，對(duì)于口服固體制劑而言，溶出度檢測(cè)是評(píng)價(jià)藥物制劑劑量和日常監(jiān)管的一個(gè)重要指標(biāo)[23]。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道了該制劑溶出度的檢測(cè)方法，但消解過程較為繁瑣，且耗時(shí)較長(zhǎng)[24]。本研究建立了一種鄰菲羅啉法測(cè)定多糖鐵復(fù)合物膠囊溶出度的方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

708-DS 型溶出儀（美國(guó)Agilent）；UV-2700i 型可見紫外分光光度計(jì)（日本島津）；XS205 型電子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司，精密度：0.000 1 g]；ME-4001 型電子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司，精密度：0.1g]；S201 型PH 計(jì)（梅特勒）；H1650-W醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，離心半徑為50 mm）；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)宇儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

多糖鐵復(fù)合物膠囊（上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，181115、181116、181117）；標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液（規(guī)格：1 000 μg/ml，貯存于1.0 mol/L 硝酸介質(zhì)中，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，定值日期：2018 年11 月5 日）；鹽酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20180223）；鹽酸羥胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20170124）；1，10-菲啰啉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20171013）；三水合乙酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20171013）；冰醋酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20160728）；磷酸二氫鉀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20171107）；氫氧化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20150324）；十二烷基硫酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，20170901）；試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 試液1 mol/L 鹽酸溶液：精密量取9 ml 濃鹽酸，置100 ml 容量瓶中，用純化水定容，搖勻，得試液Ⅰ。10%鹽酸羥胺溶液：取鹽酸羥胺10.0 g，精密稱定，置100 ml 量瓶中，加純化水溶解并定容，搖勻，得試液Ⅱ。pH 4.5 醋酸緩沖液：取三水合乙酸鈉18.0 g，精密稱定，置1 000 ml 容量瓶中，加適量水使溶解，再精密量取冰醋酸9.8 ml，置容量瓶中，加水定容，搖勻，得試液Ⅲ。0.1%菲啰啉溶液：取1，10-菲啰啉0.1 mg，精密稱定，置100 ml 量瓶中，加純化水溶解并定容，搖勻，得試液Ⅳ。

2.1.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密量取10.0 ml 標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液，移入100 ml 容量瓶中，用純化水定容，搖勻備用。

2.1.3 空白溶液 精密量取1 ml 純凈水，移入100 ml容量瓶中，再依次加入1 ml 試液Ⅰ、2 ml 試液Ⅱ、5 ml試液Ⅲ和5 ml 試液Ⅳ，用純化水定容，搖勻，即得。

2.1.4 供試品溶液 在900 ml 溶出介質(zhì)中加入1 粒多糖鐵復(fù)合物膠囊，按照溶出度測(cè)定方法操作，即得供試品溶液。

2.2 溶出度測(cè)定方法

參考文獻(xiàn)[24]中的溶出度試驗(yàn)條件，對(duì)消解方法進(jìn)行研究，確立本品的溶出度測(cè)定方法：取本品置沉降籃中，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版四部[25]通則溶出度與釋放度測(cè)定法第二法進(jìn)行，以900 ml 1%十二烷基硫酸鈉的pH 7.5 磷酸二氫鉀溶液為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，30 min 時(shí)取溶出液5 ml 置離心管中，將離心管放入離心機(jī)中，3 000 r/min 離心10 min，精密量取離心后的上清液1 ml，移入100 ml 量瓶中，加入1 ml 試液Ⅰ，密封，置90℃水浴中加熱10 min，取出，放冷，加入2 ml 試液Ⅱ，搖勻，靜置10 min，再加入試液Ⅲ和5 ml 試液Ⅳ，搖勻，靜置5 min，用純凈水定容，搖勻，靜置10 min。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版四部[25]通則0401，照紫外-可見光光度法測(cè)定吸光度，計(jì)算每粒膠囊的溶出量。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 ml，置100 ml 量瓶中，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，制備1 μg/ml 的對(duì)照品溶液。另取空白溶液、供試品溶液，分別在400～700 nm處進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，在510 nm 處對(duì)照品溶液和供試品溶液均有最大吸收，但空白溶液在此處無吸收，本檢測(cè)方法專屬性良好。

2.4 線性試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 ml，分別置100 ml 量瓶中，按照“2.2”項(xiàng)下方法，即得0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml 的系列對(duì)照品溶液，照紫外-可見分光光度法，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以鐵離子濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，鐵離子濃度在0.1～2.0 μg/ml 范圍內(nèi)，吸光度與濃度具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A=0.202 5C+0.000 66，（r2=0.999 9）。

圖1 對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下方法，由同一分析人員同法制備6 份供試品溶液并對(duì)其進(jìn)行紫外測(cè)定，6 次檢測(cè)結(jié)果的RSD 為2.73%。

2.6 溶液穩(wěn)定性

對(duì)照品溶液穩(wěn)定性：按照“2.3”項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液，室溫下放置，分別于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h依法檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液的RSD 為0.44%，提示室溫下8 h 內(nèi)，對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性良好。

供試品溶液穩(wěn)定性：按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于5、10、20、30、60、90、120 min 依法檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液的RSD 為0.55%。提示室溫條件下2 h 內(nèi)，供試品溶液的穩(wěn)定性良好。為方便操作，本實(shí)驗(yàn)選擇將供試品溶液放置10 min 后測(cè)定吸光度值。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱取多糖鐵復(fù)合物膠囊（181115）內(nèi)容物，用溶出介質(zhì)配成約含鐵150 μg/ml 的溶液，精密量取0.5 ml 樣品溶液9 份，分別置100 ml 量瓶中，加入“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、0.6、0.8 ml 各三份，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法檢測(cè)，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。平均回收率為99.30%，平均RSD 為1.03%，提示在該溶出條件及測(cè)定條件下，方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品檢測(cè)

取3 批多糖鐵復(fù)合物膠囊（每批各6 粒），按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行溶出度測(cè)定，同時(shí)對(duì)應(yīng)的溶出液按文獻(xiàn)[24]中的消解方法進(jìn)行，依法檢測(cè)溶出度，檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 兩種方法下多糖鐵復(fù)合物膠囊溶出度比較

3 討論

本研究方法經(jīng)過專屬性、線性、重復(fù)性、溶液穩(wěn)定性、回收率試驗(yàn)等方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果良好，適合多糖鐵復(fù)合物膠囊的溶出度測(cè)定。

鄰菲羅啉法測(cè)定多糖鐵復(fù)合物膠囊溶出度的原理是在酸性條件下，多糖鐵復(fù)合物發(fā)生消解，鹽酸羥胺將解離出的Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與1，10-菲啰啉結(jié)合生成化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的紅色絡(luò)合物，通過測(cè)定紅色絡(luò)合物的吸光度，計(jì)算多糖鐵復(fù)合物膠囊的溶出量。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于：①在多糖鐵復(fù)合物消解過程中使用鹽酸替換硫酸作為消解劑，避免了濃硫酸使用過程中的危險(xiǎn)性；②消解過程中提高反應(yīng)溫度至90℃，確保多糖鐵復(fù)合物被完全消解的同時(shí)，縮短了反應(yīng)時(shí)間，對(duì)于檢測(cè)過程更具可操作性；③在Fe3+被鹽酸羥胺還原成Fe2+后的溶液中加入少量的pH 4.5 醋酸緩沖液，即可使?jié)M足Fe2+與1，10-菲啰啉結(jié)合生成穩(wěn)定的紅色絡(luò)合物的條件，避免了醋酸緩沖液的過量加入。

[通訊作者]過對(duì)3 個(gè)批次的市售多糖鐵復(fù)合物膠囊溶出結(jié)果測(cè)定，本研究方法與文獻(xiàn)方法溶出結(jié)果相當(dāng)，同時(shí)本研究方法不僅操作簡(jiǎn)便、可靠，縮短測(cè)定時(shí)間，減少時(shí)間成本，而且可以大幅減少試劑的用量，降低物質(zhì)成本的同時(shí)更加有利于環(huán)境保護(hù)。