氟西汀對單眼剝奪弱視大鼠視皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性的影響及相關(guān)機(jī)制

羅賢令 吳羅玲

杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院眼科，浙江杭州 311400

弱視影響兒童視功能健康發(fā)育，對雙眼視功能及立體視覺具有影響[1-2]。研究顯示，視皮層形態(tài)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致視皮層可塑性降低是弱視發(fā)生的關(guān)鍵原因[3-4]。治療多采用常規(guī)遮蓋療法、精細(xì)目力訓(xùn)練等治療，但存在時限性等問題，且對于超過視覺發(fā)育敏感期的患者，治療效果甚微[5-7]。氟西汀是抗抑郁藥物，其可增加成年弱視大鼠視皮層神經(jīng)元可塑性，但具體機(jī)制尚未闡明[8]。研究顯示，促進(jìn)ERK/CREB 通路活化可激活腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元突觸可塑性，改善小鼠神經(jīng)功能[9]。氟西汀能夠激活CREB 通路，改善慢性應(yīng)激大鼠神經(jīng)功能[10]。目前，有關(guān)氟西汀對弱視視皮層神經(jīng)元可塑性的影響是否與調(diào)控ERK/CREB 通路有關(guān)少見報道，本研究對此進(jìn)行探究。

1 對象與方法

1.1 試驗(yàn)動物

60 只14 日齡SPF 級SD 雄性大鼠，體重（55±10）g，購于北京唯尚立德生物科技有限公司，使用許可證號SYXK（京）2021-0056，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0009。本研究經(jīng)杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（CX-006-03）。

1.2 主要試劑與儀器

氟西汀（生產(chǎn)批號：114247-09-5，海思生物技術(shù)有限公司）；醋酸雙氧鈾（生產(chǎn)批號：CAS6159-44-0，青島捷世康生物科技有限公司）；復(fù)方托吡卡胺滴眼液（生產(chǎn)批號：14200529809，華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；左旋多巴（生產(chǎn)批號：CCPE900086，廣州佳途科技股份有限公司）；兔抗鼠ERK1/2（生產(chǎn)批號：33047M）、p-ERK1/2（生產(chǎn)批號：33016M）、CREB（生產(chǎn)批號：33052M）、p-CREB（生產(chǎn)批號：33008M）及β-actin（生產(chǎn)批號：33036M）多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗（生產(chǎn)批號：33141M）均購于上海雅吉生物科技有限公司。

IX-RA-834 型小動物多功能圖形翻轉(zhuǎn)視覺誘發(fā)電位儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；BD-4R 型透射式電子顯微鏡（深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司）。

1.3 動物分組及建模

60 只大鼠選取10 只為對照組，余50 只建立單眼弱視模型并檢驗(yàn)建模是否成功。具體操作見文獻(xiàn)[11]。建模成功的50 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為陽性藥組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10 只。

1.4 藥物處理

低、中、高劑量組大鼠于之后每日早8:00 腹腔注射氟西汀5、10、20 mg/（kg·d）[12]，模型組、對照組腹腔注射等量生理鹽水，陽性藥組大鼠灌胃左旋多巴80 mg/（kg·d），給藥28 d。

1.5 圖形視覺誘發(fā)電位（pattern visual evoked potential，PVEP）檢測各組大鼠P100 潛伏期、P100 幅值

各組大鼠末次給藥結(jié)束后進(jìn)行PVEP 檢測：剪開大鼠縫合的眼瞼緣，暗室內(nèi)適應(yīng)30 min，1%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，一次性給予復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分?jǐn)U瞳，然后采用多功能圖形翻轉(zhuǎn)視覺誘發(fā)電位儀（閃爍光為刺激光，頻率為1.0 Hz，通頻帶寬0.5～85.0 Hz，分析時間250 ms，疊加60 次）進(jìn)行PVEP 檢測，連續(xù)測3 次取平均值，比較分析各組大鼠P100潛伏期、P100幅值，具體操作見文獻(xiàn)[13]。

1.6 透射電子顯微鏡觀察視皮層神經(jīng)元細(xì)胞突觸超微結(jié)構(gòu)

PVEP 檢測結(jié)束后，立即處死大鼠，取大腦左側(cè)視皮層組織，分為兩部分。其中一部分經(jīng)2.5%戊二醛、磷酸鹽緩沖液固定2 h，1%鋨酸固定液固定3 h，梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片（50 nm厚），3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，于透射電子顯微鏡下觀察皮層突觸超微結(jié)構(gòu)，并利用IPP 6.0 圖像分析軟件（美國MedrnCybernetics 公司）分析并記錄各組大鼠視皮層神經(jīng)元突觸間隙及突觸后致密物厚度。

1.7 免疫印跡法檢測視皮層組織中ERK/CREB 通路蛋白水平

將另一部分視皮層組織制備組織勻漿，提取總蛋白并檢測濃度及純度，電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉（5%）室溫封閉2 h，分別加入一抗ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB及內(nèi)參β-actin（1∶1 000）的稀釋比，次日加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，顯色、顯影、定影，根據(jù)各蛋白條帶灰度值計算各目標(biāo)基因蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠P100 潛伏期、P100 幅值比較

模型組大鼠P100潛伏期高于對照組，P100幅值低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。低、中、高劑量組大鼠P100潛伏期低于模型組，P100幅值高于模型組；中、高劑量組大鼠P100潛伏期低于低劑量組，P100幅值高于低劑量組；高劑量組大鼠P100潛伏期低于中劑量組，P100幅值高于中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠P100 潛伏期、P100 幅值比較（）

表1 各組大鼠P100 潛伏期、P100 幅值比較（）

注與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與低劑量組比較，cP ＜0.05；與中劑量組比較，dP ＜0.05

2.2 各組大鼠視皮層神經(jīng)細(xì)胞突觸超微結(jié)構(gòu)變化

對照組大鼠視皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠突觸結(jié)構(gòu)模糊，突觸間隙消失，突觸小泡隱約可見，髓鞘板層結(jié)構(gòu)松解，細(xì)胞電子密度降低，突觸結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理損傷；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠視皮層神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)稍清晰，可見突觸間隙及突觸小泡，髓鞘板層結(jié)構(gòu)清晰。見圖1。

圖1 各組大鼠視皮層神經(jīng)細(xì)胞突觸超微結(jié)構(gòu)變化（400×）

2.3 各組大鼠視皮層突觸間隙及突觸致密厚度比較

模型組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。低、中、高劑量組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度低于模型組；中、高劑量組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度低于低劑量組；高劑量組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度低于中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠視皮層突觸間隙及突觸致密厚度比較（）

表2 各組大鼠視皮層突觸間隙及突觸致密厚度比較（）

注與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與低劑量組比較，cP ＜0.05；與中劑量組比較，dP ＜0.05

2.4 各組大鼠視皮層ERK/CREB 通路蛋白比較

模型組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。低、中、高劑量組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 高于模型組；中、高劑量組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 高于低劑量組；高劑量組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 高于中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠視皮層組織中ERK/CREB 通路蛋白

表3 各組大鼠視皮層ERK/CREB 通路蛋白水平比較（）

表3 各組大鼠視皮層ERK/CREB 通路蛋白水平比較（）

注與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與低劑量組比較，cP ＜0.05；與中劑量組比較，dP ＜0.05

3 討論

弱視與視覺發(fā)育相關(guān)，多發(fā)于兒童[14]。由視覺發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)不良的視環(huán)境及單眼斜視、形覺剝奪等多種因素引起的單眼或雙眼最佳矯正視力下降[15-16]。常規(guī)治療方法存在時限性，且治療效果不佳[17-18]。氟西汀是抗抑郁藥，其對單眼形覺剝奪大鼠視覺可塑性有調(diào)控作用，但機(jī)制尚未明確[19-20]。視覺系統(tǒng)能夠根據(jù)外界視覺環(huán)境的刺激調(diào)整和改變突觸結(jié)構(gòu)，此過程為視覺發(fā)育可塑性。研究表明，視皮層神經(jīng)元突觸發(fā)育可塑性在弱視發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。

PVEP 的主要波形P100波及其波幅能反映視神經(jīng)軸索及視神經(jīng)傳導(dǎo)功能[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠P100潛伏期高于對照組，P100幅值低于對照組；低、中、高劑量組大鼠P100潛伏期低于模型組，P100幅值高于模型組。提示氟西汀可能拮抗視覺剝奪對視覺系統(tǒng)的損害，促進(jìn)視神經(jīng)鞘膜與軸索功能恢復(fù)。突觸是神經(jīng)元之間傳遞信息的重要結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)異常改變能使神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度高于對照組；低、中、高劑量組大鼠突觸間隙與突觸致密厚度低于模型組。提示氟西汀可能對神經(jīng)元細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，可改善突觸功能進(jìn)而恢復(fù)視功能。

研究顯示，ERK 通過調(diào)控CREB 參與海馬神經(jīng)細(xì)胞新樹突棘的生成，CREB 是細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)因子，參與神經(jīng)元生長、突觸可塑性等，其轉(zhuǎn)錄活性依賴于第133 位絲氨酸殘基的磷酸化反應(yīng)，p-CREB 可通過調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄活性參與神經(jīng)元的生長[23-24]。金霏等[25]研究顯示，促進(jìn)CREB 通路活化可對小鼠海馬神經(jīng)元突觸功能發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 水平低于對照組；低、中、高劑量組大鼠視皮層組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-CREB/CREB 水平高于模型組。提示氟西汀可能通過促進(jìn)ERK/CREB 通路活化對單眼剝奪弱視大鼠視皮層神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性的恢復(fù)發(fā)揮促進(jìn)作用。

綜上，氟西汀能夠恢復(fù)單眼剝奪弱視大鼠視皮層神經(jīng)細(xì)胞突觸超微結(jié)構(gòu)，激活視皮層結(jié)構(gòu)可塑性，可能是通過激活ERK/CREB 通路實(shí)現(xiàn)的。