豬偽狂犬病病毒特點(diǎn)及分離鑒定

周仁峰

（江蘇省濱?？h濱淮鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，江蘇 濱海 224500）

0 引言

豬偽狂犬病病毒感染易引起豬偽狂犬病，屬于嚴(yán)重的烈性傳染性疾病，流行性比較廣，控制不當(dāng)或不及時(shí)，可能導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益嚴(yán)重受損，需加強(qiáng)病毒分離鑒定工作，為后續(xù)治療提供依據(jù)。在病毒分離鑒定中，方法較多，如中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附等方法，在實(shí)際中應(yīng)結(jié)合具體情況，選擇合適的檢測(cè)方法，保證一定的靈敏性及特異性，減少漏檢、誤檢的情況。本文總結(jié)豬偽狂犬病病毒的特點(diǎn)、感染癥狀及病理變化等情況，并對(duì)常見的病毒分離鑒定方法展開分析，旨在為實(shí)際工作奠定理論基礎(chǔ)。

1 豬偽狂犬病病毒特點(diǎn)

豬偽狂犬病病毒屬于一種皰疹病毒，對(duì)環(huán)境的耐受性較強(qiáng)，在物體表面或者液體中的存活時(shí)間可達(dá)到1周，即便是pH值為4～9的環(huán)境下，也能保持穩(wěn)定狀態(tài)[1]。粒子呈現(xiàn)橢圓形或者圓形，耐熱性強(qiáng)，但是對(duì)紫外線、福爾馬林及脂溶性物質(zhì)比較敏感，將其置于氫氧化鈉溶液中（0.5%～1%），則快速失活。此病毒在全世界范圍內(nèi)均有分布，可以感染豬、貓、犬及牛等家畜，對(duì)水貂等野生動(dòng)物也有一定致病性，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，豚鼠、家兔及小鼠等均是常見宿主。此病毒主要會(huì)引發(fā)偽狂犬病，病豬及帶毒豬是主要的傳染源，未感染的健康豬群與患病或者攜帶病毒的豬接觸，便會(huì)引起感染，包括皮膚損傷、消化道及呼吸道等途徑，其中以空氣傳播為主要途徑，乳汁、精液及分泌物也可能會(huì)造成病毒傳播。

2 臨床癥狀與病理變化

如果感染豬偽狂犬病病毒，一般出現(xiàn)呼吸困難、精神萎靡、痙攣、嘔吐、體溫升高及抽搐等表現(xiàn)，隨著病情發(fā)展，還可能引起昏迷甚至是死亡等情況，尤其是4周齡內(nèi)的仔豬或者初生仔豬，非常容易被感染[2]。如果是妊娠期母豬發(fā)病，可見便秘、食欲下降等典型癥狀，同時(shí)出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)木乃伊胎等現(xiàn)象。公豬感染偽狂犬病病毒后，引起睪丸萎縮、腫脹，失去其生育作用，后備母豬引起不孕。對(duì)病死豬剖檢發(fā)現(xiàn)，偽狂犬病病毒感染后，出現(xiàn)明顯的病理變化，包括腎臟針尖狀出血點(diǎn)，腦膜部分存在明顯充血現(xiàn)象，且腦脊髓液比較多，伴有顯著的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。同時(shí)存在一定卡他性胃炎及腸炎，肝臟、脾臟等臟器出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性改變，表現(xiàn)為灰白色病死灶，還會(huì)發(fā)生肺水腫及充血的情況，也具有不同程度的壞死點(diǎn)。

仔豬感染后出現(xiàn)的癥狀和細(xì)菌疾病、豬瘟等混合感染有所類似，藍(lán)耳病等也會(huì)出現(xiàn)死胎的情況，非常容易出現(xiàn)誤診，影響后續(xù)有效防控措施的實(shí)施，甚至可能措施最佳治療時(shí)間，導(dǎo)致病毒大范圍傳播，給養(yǎng)殖戶造成比較嚴(yán)重的損失。需加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，如果疑似鏈球菌感染或者豬瘟等疾病，但是接種相關(guān)疫苗或者使用頭孢類藥物，并未得到良好控制，應(yīng)及時(shí)將病變樣本送檢，明確具體病原體，再進(jìn)行相應(yīng)的疾病防控處理，才能獲取理想效果。待病情穩(wěn)定后，可定期接種相關(guān)疫苗，對(duì)于初生的仔豬使用滴鼻免疫的方法，提升整體免疫力。

3 豬偽狂犬病危害

豬偽狂犬病病毒感染是養(yǎng)殖戶重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題，如果發(fā)生感染，且未做好有效控制措施，嚴(yán)重威脅豬的生長(zhǎng)發(fā)育及生殖狀況，給養(yǎng)殖戶造成比較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。需要重視此疾病的防控力度，盡量規(guī)避經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)格遵循疫苗接種流程執(zhí)行，定期進(jìn)行清潔、消毒，維護(hù)豬舍的衛(wèi)生，科學(xué)處理污水、排泄物，對(duì)飼料用具等也應(yīng)加強(qiáng)消毒處理，以免發(fā)生交叉感染。徹底清理老鼠洞或者其他動(dòng)物巢穴，做好防蚊、防蟲工作，包括使用蚊蟲藥等方法，切斷病毒傳播途徑，以免導(dǎo)致不必要的損失。

3.1 種豬

實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豬偽狂犬病病毒感染種豬后，對(duì)母豬的胎盤造成損害，直接侵入子宮感染胎兒，引起過(guò)早夭折。如果是在妊娠早期，子宮內(nèi)的胚胎會(huì)被吸收，表現(xiàn)為假懷孕，影響母豬返情率[4]。如果是在妊娠中期，便會(huì)引起流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎等情況，即便是產(chǎn)下活胎，其身體狀況較差，通常在一段時(shí)間后便會(huì)夭折。除以上生殖障礙外，也可能導(dǎo)致種豬永久喪失配種能力，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)一定經(jīng)濟(jì)損失。

3.2 哺乳仔豬

豬偽狂犬病病毒可以乳汁、尿液等傳播，感染性比較強(qiáng)，一般以4周齡內(nèi)的仔豬為主，其對(duì)病毒的抵抗力比較弱，即便出生時(shí)沒(méi)有發(fā)生明顯異常情況，也可能會(huì)在出生后第2天大范圍死亡。早期出現(xiàn)不進(jìn)食、高溫、呼吸困難等現(xiàn)象，隨著病情發(fā)展，表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀，最終引起死亡。

3.3 斷奶仔豬

如果在斷奶后感染病毒，仔豬出現(xiàn)腹瀉、厭食及高熱等表現(xiàn)，由于個(gè)體差異的原因，部分還可能發(fā)生眼球外翻、呼吸困難、角弓反張及咳嗽等表現(xiàn)，發(fā)育情況也不理想。

3.4 生長(zhǎng)育肥豬

如果是在正常飼養(yǎng)階段感染病毒，引起咳嗽、呼吸困難及氣喘等情況，對(duì)其生命安全造成一定威脅。還會(huì)增加豬肺疫、副嗜血桿菌病等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致個(gè)體生長(zhǎng)遲緩，甚至出現(xiàn)停止生長(zhǎng)的情況，嚴(yán)重影響飼料回報(bào)率，造成養(yǎng)殖成本增加，經(jīng)濟(jì)效益降低[5]。

4 豬偽狂犬病病毒分離鑒定方法

不同的病毒具有的毒力各有差異，如GN9801株，危害性較大，病程長(zhǎng)，可以導(dǎo)致死胎、流產(chǎn)，但是發(fā)病率比較低。隨著生物科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，豬偽狂犬病檢測(cè)方法不斷更新，包括血清學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)方法等，如中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附，能對(duì)相應(yīng)的病毒進(jìn)行良好區(qū)分和鑒別，敏感性均比較高。在實(shí)際過(guò)程中，豬如果感染偽狂犬病病毒，通常難以徹底清除，需要將被感染的種豬徹底淘汰，徹底終止病毒的傳播，否則如果豬群受到應(yīng)激或者免疫力下降，可能會(huì)造成疾病反復(fù)，病毒進(jìn)一步擴(kuò)散，安全隱患較大。

4.1 病毒分離培養(yǎng)

采集病豬的肺、腦等組織樣本，將其進(jìn)行剪碎、勻漿等處理，根據(jù)說(shuō)明書要求加入適量Hank's平衡鹽溶液，制成組織混懸液，并進(jìn)行離心處理，取上清液。在無(wú)菌環(huán)境下，使用微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，并添加鏈霉素及青霉素等試劑，最后將混合物置于-40 ℃溫度下保存[6]。

選擇PK-15細(xì)胞作為病毒培養(yǎng)基，取上述病料1 mL接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，并設(shè)置陰性對(duì)照，在37 ℃環(huán)境下培育1 h左右，再添加10 mL細(xì)胞維持液，持續(xù)培養(yǎng)48 h后再觀察生長(zhǎng)情況。經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)，直至細(xì)胞病變時(shí)間穩(wěn)定，便可以中止該環(huán)節(jié)，將培養(yǎng)物保存于-40 ℃環(huán)境。

4.2 病毒鑒定

（1）中和試驗(yàn)。屬于比較經(jīng)典的檢測(cè)方法，將連續(xù)倍比稀釋的血清和病毒株互相混勻，形成1∶1的混合物，靜置于37 ℃環(huán)境下1 h，選擇96孔的培養(yǎng)板培育雞胚成纖維細(xì)胞或者豬腎繼代細(xì)胞，并接種病毒株混合物，置于5% CO2、37 ℃環(huán)境下，對(duì)細(xì)胞病變進(jìn)行觀察，確定血清中和效價(jià)，如果數(shù)值不低于1/2，即可認(rèn)定為陽(yáng)性。該方法工作量較大，且操作復(fù)雜，容易受到細(xì)胞、技術(shù)等條件的影響，制約實(shí)際臨床應(yīng)用情況。

（2）酶聯(lián)免疫吸附。該方法敏感性、特異性較高，操作簡(jiǎn)便，能快速進(jìn)行檢測(cè)，比較適用于大批量的樣品測(cè)定，其中，早期檢測(cè)可以選擇IgM-ELISA。隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，我國(guó)已經(jīng)逐漸形成比較成熟的疫苗毒株、野毒的鑒別方法和經(jīng)驗(yàn)[7]。如gE-ELISA、gE-LAT，敏感性比較高，且具有良好的重復(fù)性，能有效區(qū)分自然感染野毒的陽(yáng)性豬、疫苗活苗免疫豬，比較適合豬偽狂犬病診斷。此外，雙抗體夾心檢測(cè)也具有良好的特異性和敏感性，在組織PRV檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。

（3）乳膠凝集試驗(yàn)。主要是基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，抗原和乳膠結(jié)合后，再與血清進(jìn)行充分反應(yīng)，如果在規(guī)定時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)凝集，則提示為陽(yáng)性，在豬偽狂犬病鑒別診斷中應(yīng)用較廣。目前已出現(xiàn)LAT診斷試劑盒，操作比較方便，且敏感性高，具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，比較適合流行病學(xué)調(diào)查、疫病監(jiān)測(cè)，也可以用于豬群初次篩選。

（4）膠體金免疫層析?；赑CR技術(shù)，克隆表位基因并插至目標(biāo)載體，形成表達(dá)質(zhì)粒后誘導(dǎo)表達(dá)，再結(jié)合膠體金標(biāo)記，建立免疫層析試紙，可直接用于疾病臨床診斷，操作比較簡(jiǎn)單，且特異性和靈敏度均較高[8]。試紙可以在室溫條件下長(zhǎng)期保存，不會(huì)對(duì)敏感性、特異性造成明顯影響，該方法可用作野毒感染快速篩查。

（5）分子生物學(xué)方法。核酸探針屬于常見的分子生物學(xué)方法，雜交法等手段，標(biāo)記基因組DNA，并將重組質(zhì)量作為探針，對(duì)病毒進(jìn)行鑒定、檢測(cè)，特異性較高。與此同時(shí)，也可以使用基因芯片的方法，獲取PRVgB等靶基因，制備相應(yīng)的檢測(cè)基因芯片，靈敏度高，芯片質(zhì)量較好且可重復(fù)利用，也具有良好的重復(fù)性，能實(shí)現(xiàn)豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒等同時(shí)檢測(cè)的目的，對(duì)基因缺失疫苗毒及野毒進(jìn)行區(qū)分，診斷應(yīng)用前景好。

（6）PCR方法。包括多重PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等方法，其中，多重PCR技術(shù)比較常用，操作簡(jiǎn)單易行，具有敏感性高、快速的特點(diǎn)。目前豬偽狂犬病及其他病毒病均可以采用該方法檢測(cè)，特異性好，能有效區(qū)分不同疾病，對(duì)于混合感染的檢測(cè)也具有積極意義，能在一定程度上節(jié)省人力和檢測(cè)時(shí)間，可以用作常用的流行病學(xué)調(diào)查手段。實(shí)時(shí)定量PCR能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，具有快速、敏感等特點(diǎn)，可用于大量樣品的檢測(cè)，主要是基于病毒基因序列，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增比較適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，屬于新興技術(shù)，反應(yīng)速度及引物設(shè)計(jì)等均有明顯優(yōu)勢(shì)，性能優(yōu)異，適用范圍比較廣。相比普通的PCR檢測(cè)技術(shù)，其特異性更好，靈敏度高，能在早期對(duì)自然感染野毒、基因缺失疫苗進(jìn)行快速區(qū)分。

5 結(jié)束語(yǔ)

豬是偽狂犬病毒常見的傳播者、宿主，易引起急性傳染，導(dǎo)致呼吸困難、體溫升高及其他神經(jīng)癥狀，影響其正常生長(zhǎng)發(fā)育，如果是種豬感染，還會(huì)導(dǎo)致死胎、流產(chǎn)等，對(duì)公豬的生育價(jià)值造成損害，且死亡率較高，給養(yǎng)殖戶造成比較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該疾病呈現(xiàn)散發(fā)特征，如果未及時(shí)進(jìn)行合理控制，可能會(huì)導(dǎo)致大范圍傳播，通常仔豬更容易發(fā)病，加強(qiáng)病毒分離鑒定，能及時(shí)明確病原，便于采取針對(duì)性的干預(yù)措施。如中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)等方法，效果比較理想，可獲得較高的敏感度和特異性。有效病毒分離鑒定，能快速明確致病源，根據(jù)病毒特點(diǎn)，在日常清潔和消毒的同時(shí)，開展相應(yīng)的病毒預(yù)防措施，有效降低養(yǎng)殖場(chǎng)的損失，為我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供支持。