湘西桐葉藥材熊果酸及齊墩果酸的HPLC法測(cè)定*

徐玉輝，周佳妮，覃愛桃，韓湘云，楊德泉

(1.湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000；2.湘西宏成制藥有限責(zé)任公司，湖南 吉首 416000)

桐葉為玄參科植物白花泡桐(Paulowniafortunei(Seem.)Hemsl.)的干燥葉，是土家成藥復(fù)方桐葉燒傷油的原料藥材.桐葉性冷、味苦，具有趕火敗毒，止血消腫的功效，常被用于治療燒燙傷、創(chuàng)傷出血、癰疽疔瘡等.桐葉的主要成份為齊墩果酸、熊果酸、木犀草素等化合物[1-2].桐葉藥材標(biāo)準(zhǔn)收載于《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(2009年版)》[3].為了解和評(píng)價(jià)湘西產(chǎn)桐葉藥材的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法，測(cè)定了湘西產(chǎn)桐葉的熊果酸和齊墩果酸含量，報(bào)道如下.

1 儀器、試藥和樣品

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；AUW220D電子天平(日本島津公司)；KQ-3008超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司).

1.2 試藥和樣品

熊果酸(批號(hào)：110742-201823，99.9%)，齊墩果酸(批號(hào)：110709-201808，91.1%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院.乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑為分析純.

桐葉樣品由本項(xiàng)目組人員采集于湘西土家族苗族自治州境內(nèi)，采集時(shí)間為2021年7—9月，共17批(其中湘西宏成制藥有限責(zé)任公司提供2批)，具體地點(diǎn)見表1.

表1 湘西產(chǎn)桐葉采樣表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：TADE-PAK AF-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液(體積比61∶18∶21)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL.

2.2 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

準(zhǔn)確稱取熊果酸對(duì)照品49.81 mg、齊墩果酸對(duì)照品13.85 mg，分別置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，作為熊果酸、齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度分別為0.995 2，0.252 3 mg/mL.

2.3 供試品溶液的制備

桐葉藥材粉碎研磨后過3號(hào)篩.準(zhǔn)確稱取桐葉粉末約0.4 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲30 min，過濾，濾液置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液.

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按2.1色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰的理論板數(shù)，熊果酸為8 678，齊墩果酸為7 802，齊墩果酸與熊果酸分離度為1.73，均符合要求.供試品溶液兩主峰的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液相應(yīng)兩主峰的保留時(shí)間一致.對(duì)照品、供試品色譜圖見圖1、圖2.

1—齊墩果酸；2—熊果酸.

1—齊墩果酸；2—熊果酸.

2.5 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確吸取齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5，1，3，4，6，10 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，配制成含熊果酸0.049 7，0.099 5，0.298 6，0.398 1，0.597 1，0.995 2 mg/mL，含齊墩果酸0.012 6，0.025 2，0.075 7，0.100 9，0.151 4，0.252 3 mg/mL的系列對(duì)照品溶液.分別精密吸取上述系列對(duì)照品溶液10 μL，按2.1節(jié)下色譜條件進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理，熊果酸回歸方程為Y=4 686.574 2X-6.525 9，r=0.999 9；齊墩果酸回歸方程為Y=5 273.108 2X+1.175 9，r=0.999 9.結(jié)果表明，熊果酸在0.497 6～9.952 μg/mL、齊墩果酸在0.126 1～2.523 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2.6 精密度試驗(yàn)

取T1號(hào)樣品供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得熊果酸、齊墩果酸含量測(cè)定值的RSD均為1.1%，說明儀器精密度高.

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取T1號(hào)樣品粉末6份，各0.4 g，精密稱定，按照2.3節(jié)下方法制備供試品溶液，然后按照2.1節(jié)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定.熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.932 5，6.924 3，7.000 2，6.952 1，6.919 3，7.047 4 mg/g，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.962 6 mg/g，RSD為0.74%；齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.927 0，2.920 1，2.976 9，2.981 8，2.904 2，2.977 1 mg/g，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.947 8 mg/g，RSD為1.17%，表明HPLC法重復(fù)性良好.

2.8 耐用性試驗(yàn)

分別用液相色譜儀Agilent 1260Ⅱ，色譜柱Agilent C18(250 mm ×4.6 mm×5 μm，編號(hào)為588905-902，Agilent公司)和高效液相色譜儀LC-20AT，色譜柱YMC C18(250 mm×4.6 mm×5 μm，編號(hào)為HS12S05-2546WT，YMC公司)進(jìn)行試驗(yàn)，理論塔板數(shù)按熊果酸計(jì)，均可達(dá)5 000以上.取T1號(hào)樣品供試液，測(cè)定其中熊果酸和齊墩果酸含量，測(cè)得熊果酸、齊墩果酸含量測(cè)定值的RSD分別為0.64%，1.54%.結(jié)果表明，HPLC法耐用性良好.

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取T1號(hào)樣品供試品溶液，放置0，1，2，4，8，12，24 h后，進(jìn)樣測(cè)定熊果酸和齊墩果酸含量，測(cè)得熊果酸、齊墩果酸含量測(cè)定值的RSD分別為1.43%，1.12%，表明HPLC法穩(wěn)定性高.

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取T1號(hào)樣品粉末6份，每份0.4 g(水份：9.93%，按干燥品計(jì)算出樣品中含熊果酸6.962 6 mg/g、齊墩果酸2.947 8 mg/g)，分別按已測(cè)得含量的80%，100%，120%，對(duì)應(yīng)加入熊果酸對(duì)照品5.582 0，7.029 2，8.269 6 mg，齊墩果酸對(duì)照品2.372 2,2.965 2，3.558 2 mg，按供試液制備方法制備成為供試液，按2.1節(jié)下色譜條件測(cè)定，熊果酸、齊墩果酸加樣回收率結(jié)果如表2、表3所示，T1號(hào)樣品加入已測(cè)含量的80%，100%，120%熊果酸對(duì)照品后，平均回收率分別達(dá)100.15%，99.13%，100.60%；T1號(hào)樣品加入已測(cè)含量的80%，100%，120%齊墩果酸對(duì)照品后，平均回收率分別達(dá)97.55%，100.73%，98.62%，表明HPLC法準(zhǔn)確度高.

表2 熊果酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表3 齊墩果酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取桐葉粉末(過3號(hào)篩)0.4 g，置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲30 min，過濾，濾液置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，為供試品溶液.按2.1節(jié)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定熊果酸、齊墩果酸的峰面積，用回歸方程計(jì)算出供試品溶液中熊果酸、齊墩果酸的含量，同時(shí)測(cè)定各樣品的水份.17批樣品中熊果酸和齊墩果酸含量的測(cè)定結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明湘西桐葉中熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.543 5～7.072 5 mg/g，齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.505 5～3.202 6 mg/g，不同產(chǎn)地桐葉中熊果酸、齊墩果酸含量略有差異.

表4 桐葉中熊果酸和齊墩果酸含量

3 討論

李科等[4]曾采用HPLC法檢測(cè)了產(chǎn)于湘西宏成制藥有限公司基地的桐葉中所含的熊果酸、木犀草素含量，其中熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.57 mg/g.本研究采集了湘西境內(nèi)8個(gè)縣(市)所產(chǎn)的17批桐葉藥材，檢測(cè)了其中熊果酸和齊墩果酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.54～7.07 mg/g，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.25 mg/g，接近于李科等[4]研究結(jié)果；齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.50～3.20 mg/g，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.82 mg/g.本研究結(jié)果顯示，在7—9月，湘西不同產(chǎn)地的桐葉中熊果酸、齊墩果酸含量水平略有差異，可能與各產(chǎn)地白花泡桐生長(zhǎng)的土壤、雨水、光照、氣溫等環(huán)境條件不一致有關(guān).本研究結(jié)果可為了解和評(píng)價(jià)湘西產(chǎn)桐葉的質(zhì)量提供參考.

本研究使用HPLC法測(cè)定桐葉藥材中熊果酸和齊墩果酸的含量，研究發(fā)現(xiàn)此方法具備如下優(yōu)點(diǎn)：(1)分離效果好，齊墩果酸與熊果酸分離度為1.73，與其他成分完全分離；(2)良好的線性關(guān)系，熊果酸在0.497 6～9.952 0 μg/mL、齊墩果酸在0.126 1～2.523 0 μg/mL范圍內(nèi)r值可達(dá)0.999 9；(3)重復(fù)性、耐用性、穩(wěn)定性良好，相應(yīng)測(cè)定結(jié)果的RSD均小于2%；(4)精密度、準(zhǔn)確度高，熊果酸、齊墩果酸平均加樣回收率可達(dá)97%以上.綜上，HPLC法是檢測(cè)桐葉主要成分熊果酸和齊墩果酸的科學(xué)有效手段.