動物產(chǎn)品中腹瀉性貝類毒素檢測方法研究

陳 盼,胡憶文,侯義宏,禹思宇,陸 靜,譚建錫※,唐連飛※

(1.長沙縣食品藥品安全檢測中心,湖南 長沙 410010;2.長沙海關(guān)技術(shù)中心,湖南 長沙 410004)

岡田酸(Okadaic acid,OA)，又被稱為大田軟海綿酸、黑海綿酸，是腹瀉性貝類毒素的主要成分之一，屬于脂溶性多環(huán)醚物質(zhì)，主要由有毒藻類產(chǎn)生。腹瀉性貝類毒素經(jīng)食藻魚類或貝類捕食有毒藻類后在其體內(nèi)富集，但該類毒素對貝類等本身并不造成致死影響，當(dāng)人類食用這些魚類或貝類等動物產(chǎn)品后，可導(dǎo)致胃腸功能障礙等一系列中毒癥狀，如惡心、嘔吐和腹瀉等。除此之外，實驗證明OA存在很強的慢性毒性，是一種強烈的致癌物質(zhì)，可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)過度磷酸化，促使細胞凋亡和誘導(dǎo)腫瘤形成，最終發(fā)生癌變。研究表明，腹瀉性貝類毒素幾乎在全球范圍內(nèi)都有分布。近年來因食用貝類等動物產(chǎn)品的中毒事件時有發(fā)生，己成為公共安全隱患[1-3]。因此，利用有效手段對OA進行檢測，對保障環(huán)境和食品安全都有著重要的意義。

核酸適體(aptamer)是通過體外篩選技術(shù)-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponcntial enrichment,SELEX)，針對目的靶標(biāo)篩選得到的特定單鏈寡核苷酸序列，但對靶標(biāo)有更高的特異性和親和力。且可在體外合成，具有熱穩(wěn)定性好、易于修飾、成本低等優(yōu)點，基于其構(gòu)建的生物傳感器方法等得到廣泛的研究及應(yīng)用[4-6]。

本研究基于腹瀉性貝類毒素岡田酸核酸適體，構(gòu)建了特異性適體輔助識別體系平臺，探討小分子核酸適體快速檢測水產(chǎn)品等動物產(chǎn)品中腹瀉性貝類毒素岡田酸的有效方法，保障養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和食品安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)文獻設(shè)計帶有修飾標(biāo)記的OA特異性適體序列[7]，由上海生工生物股份有限公司合成。鏈霉親和素標(biāo)記微孔板購自美國Thermo公司。

體系緩沖溶液:50 mM Tris-HCL(pH7.6)，5mM MgCl2溶液，150 mM NaCl溶液。洗滌緩沖溶液：PBST濃縮液(英國朗道公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(美國sigma公司)；恒溫水浴鍋(德國Memmer公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國TECAN公司)。

1.3 溶液體系制備方法

核苷酸用去核酸水溶解成100 μM母液，后將母液進行稀釋，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 體系包被處理

加入OA特異性適體與互補探針雜交（終濃度1 μM），體系緩沖溶液置于95℃中5 min。在鏈霉親和素標(biāo)記微孔板中加入30μL OA特異性適體與互補探針雜交溶液，置于37℃反應(yīng)1 h后用洗滌緩沖液洗滌備用。

1.5 檢測步驟優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度用體系緩沖液稀釋后，分別吸取取100 μL加入到上述包被微孔板中，室溫下孵育半小時后，用洗滌緩沖液洗滌；拍干后，接著加入鏈霉親和素標(biāo)記-HRP(50 μL/孔)，于室溫孵育半小時后移去反應(yīng)液，用洗滌緩沖液洗滌；然后，加入底物顯色液，反應(yīng)半小時后觀察顏色變化。最后，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測定其吸光度值。

1.6 實驗可行性檢測

a.空白組，微孔板包被處理后，加入0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL。

b.微孔板進行包被處理后，加入0.02 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL。

c.微孔板進行包被處理后，加入0.2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL。

d.對照組，微孔板不包被處理，加入0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL。

1.7 檢測條件

設(shè)定酶標(biāo)儀波長300 nm～600 nm，掃描測定體系溶液的波譜圖，并根據(jù)測量吸光度值繪制吸光度與OA濃度線形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 平臺構(gòu)建可行性

OA特異性適體與互補探針雜交，兩者可形成復(fù)合物；并利用生物素（Biotin）修飾后，加入到鏈霉親和素標(biāo)記微孔板上，通過生物素和鏈霉親和素兩者之間的特異相互作用，可使復(fù)合物固定在鏈霉親和素結(jié)合微孔板上。當(dāng)存在OA時，特異性結(jié)合適體形成雙鏈復(fù)合物，導(dǎo)致適體被脫離，無法結(jié)合HRP，從而不能催化底物顯色。不存在OA時，形成復(fù)合物被固定于微孔板上，進而與HRP結(jié)合，底物被催化后由無色變?yōu)樗{色，反應(yīng)被終止后溶液變成黃色。

2.2 檢測實際應(yīng)用可行性

顯色體系底物在酶的催化下逐漸產(chǎn)生顏色，在優(yōu)化的實驗條件下，顏色逐漸變?yōu)榈{色。隨著作用時間的延長，在未加入終止液時，體系顏色呈現(xiàn)淡藍色并逐漸加深。且隨著標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的增加，從0 mg/L～0.2 mg/L時，顏色也隨之變淺。結(jié)果顯示，在空白組微孔板只進行包被處理，然后加入0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，體系顏色最深（a）；在對照組體系，微孔板未進行包被處理，反應(yīng)后溶液顏色最淺（d）。顯色體系在未被終止前，由于藍色產(chǎn)物辨識度相較于黃色產(chǎn)物更高，可用裸眼進行初步觀察。在加入酸被終止后，溶液顏色變?yōu)辄S色，在300 nm～600 nm波長進行掃描，最大吸收峰顯示在450 nm波長處（見圖1）。同時，通過圖2中可以看到，隨著濃度增加(0 mg/L～0.2 mg/L)，體系在450 nm波長的吸光度值逐漸減小。在空白組a中獲得最大吸光度值，在對照組d中獲得最小吸光度值。從上面的結(jié)果可以推斷，OA與核酸適體序列發(fā)生特異性識別，使其從雙鏈復(fù)合物中被釋放到體系中，導(dǎo)致可結(jié)合標(biāo)記酶催化反應(yīng)程度不同，從而產(chǎn)生不同程度的顏色反應(yīng)，最終產(chǎn)生不同的吸光度值，并可從側(cè)面反映出溶液中的靶標(biāo)含量。

圖1 不同波長對底物顯色后的掃描結(jié)果Fig.1 Scanning resultsafter substrate color development at different wavelengths

圖2 不同體系濃度孵育后吸光度值Fig.2 Absorbance values after incubation with different system concentrations

3 討論

腹瀉性貝類毒素的檢測方法主要包括小鼠分析法、化學(xué)分析法、免疫分析法[8-10]。小鼠分析法曾作為美國官方分析化學(xué)師協(xié)會(AOAC)的標(biāo)準(zhǔn)方法使用，但由于小鼠的個體差異以及涉及到倫理問題，該方法已基本不再使用?；瘜W(xué)分析法具有檢測限低、準(zhǔn)確性高、靈敏度好等優(yōu)勢，適于實驗室較高精度需求，但通常需要高效液相色譜(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，儀器較為昂貴，在推廣普及使用中存在困難。免疫分析法因具有特異性良好、靈敏度和穩(wěn)定性高等優(yōu)點，其應(yīng)用較為廣泛，但較易受到環(huán)境因素的干擾影響，如離子強度、pH等，在現(xiàn)場快速檢測使用中存在局限性。

本研究基于核酸適體與靶標(biāo)間的高特異性結(jié)合力，以O(shè)A適體為特異性識別元件，探討基于小分子核酸適體快速檢測動物產(chǎn)品中腹瀉性貝類毒素的可行性。該方法可根據(jù)底物濃度不同，產(chǎn)生不同程度的顏色反應(yīng)，用肉眼進行初步判斷，具有操作步驟簡便、成本低、對檢測硬件要求低等優(yōu)點,為基層養(yǎng)殖現(xiàn)場快速、簡便初篩檢測提供了全新的思路。