液相色譜法測定鞋類產(chǎn)品中的六種鄰苯二甲酸酯

馮徐根，白子竹，黃志丁，魯彩霞，楊萌

（1.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院國家紡織及皮革產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心，北京100025；2.國家市場監(jiān)督管理總局認(rèn)證認(rèn)可技術(shù)研究中心，北京100020）

鄰苯二甲酸酯一般為揮發(fā)性低、穩(wěn)定性高且具有芳香氣味或無氣味的粘稠油狀液體，具有增強(qiáng)聚合物的可塑性、柔韌性和流動性等作用，被廣泛用作塑化劑。此外鄰苯二甲酸酯具有雌激素活性，可以干擾人體的內(nèi)分泌，同時具有潛在的致癌、致畸和致突變等危害[1-3]。

我國國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB30585-2014《兒童鞋安全技術(shù)規(guī)范》[4]中對鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二-（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二-辛酯（DNOP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP）共六種鄰苯二甲酸酯進(jìn)行了限量。ISO/TS16181:2011和國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T32440：2015《鞋類鞋類和鞋類部件中存在的限量物質(zhì)鄰苯二甲酸酯的測定》[5]中給出了使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定這六種鄰苯二甲酸酯的檢測方法，但該方法需要同時使用內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行分析且儀器分析時間長達(dá)34 min，此外DINP和DIDP在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上峰形呈簇峰形態(tài)，給譜圖分析過程增加了一定難度。

目前檢測鄰苯二甲酸酯的方法主要有氣相色譜法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、液相色譜法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[10-11]，查閱相關(guān)文獻(xiàn)針對液相色譜法，目前無學(xué)者研究過鞋類產(chǎn)品中六種鄰苯二甲酸酯的檢測，經(jīng)本試驗(yàn)證明：本方法無需內(nèi)標(biāo)物，無氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測DINP和DIDP的簇峰現(xiàn)象，檢測時間僅為16 min，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，可以滿足鞋類產(chǎn)品中六種鄰苯二甲酸酯的檢測。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：液相色譜儀Agilent 1260 Infinity（安捷倫科技有限公司）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent 7890A-5975C（安捷倫科技有限公司）；超聲波發(fā)生器JP-040（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、試劑、材料：BBP（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，98.57%，PANPHY）；DBP（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，99.4%，Bepure）；DEHP（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，99.39%，Dr Ehrenstorfer）；DNOP（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，99.29%，Dr Ehrenstorfer）；DINP（標(biāo) 準(zhǔn) 物 質(zhì)，99.7%，Dr Ehrenstorfer）；DIDP（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，98.41%，Dr Ehrenstorfer）；丙酮（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

單種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取0.0200 g的BBP、DBP、DEHP、DNOP、DINP、DIDP，用色譜純正己烷定容至5 mL，得到六種鄰苯二甲酸酯質(zhì)量濃度均為4000 μg/mL的單種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：分別準(zhǔn)確移取0.625 mL的六種鄰苯二甲酸酯單種標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用色譜純正己烷定容至5 mL，得到六種鄰苯二甲酸酯濃度均為500 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制：分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0至5 mL棕色容量瓶中，用色譜純正己烷定容，得到六種鄰苯二甲酸酯質(zhì)量濃度為10、20、40、60、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3 儀器分析條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流動相A：二級水，流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0~7 min，20%A等度洗脫；7~9 min，A由20%線性降至0%，保持7 min；二極管陣列檢測器，檢測波長：226 nm，參比波長：325 nm；定量方法：外標(biāo)法。六種鄰苯二甲酸酯液相色譜圖見圖1。

圖1 六種鄰苯二甲酸酯的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of six phthalates

1.4 前處理

將樣品剪成5 mm×5 mm樣塊，準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品置于具塞三角瓶中，加入40 mL色譜純正己烷/丙酮混合溶液，置于50℃超聲波水浴中萃取1 h。萃取液冷過濾后轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中，用色譜純正己烷定容，萃取液經(jīng)0.45 μm有機(jī)相濾膜過濾，使用LC-DAD進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 DAD檢測波長的確定

使用二極管陣列檢測器對質(zhì)量濃度為100 μg/mL的六種鄰苯二甲酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜全掃描分析，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，BBP在225 nm有最大特征吸收，DNOP在224 nm有 最 大 特 征 吸 收，DBP、DEHP、DINP和DIDP均在226 nm有最大特征吸收，綜合考慮確定226 nm作為六種鄰苯二甲酸酯的檢測波長，同時取325 nm作為參比波長，減少背景干擾。

圖2 六種鄰苯二甲酸酯二極管陣列檢測器紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorption spectra of six phthalates

2.1.2 流動相的選擇

鄰苯二甲酸酯易溶于正己烷、甲醇或乙腈有機(jī)溶劑中，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用反相色譜柱分析鄰苯二甲酸酯物質(zhì)，而正己烷更適用于正向色譜，所以不考慮正己烷作為流動相，此外甲醇和乙腈的截止吸收波長分別為205 nm和190 nm，對鄰苯二甲酸酯檢測的干擾較小，所以考察甲醇-水流動相體系和乙腈-水流動相體系對鄰苯二甲酸酯檢測的影響。結(jié)果表明：使用甲醇-水流動相體系時，背景干擾少，峰形更加尖銳且六種鄰苯二甲酸酯色譜分離效果更好，所以選擇甲醇-水流動相體系。

一般情況下適量的使用無機(jī)鹽溶液作為流動相可以改善峰形，所以本試驗(yàn)考察甲醇-水流動相體系和甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液流動相體系對色譜峰峰形和保留時間的影響，結(jié)果見圖3和表1。

由圖3和表1可知，甲醇-水流動相體系和甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液流動相體系對六種鄰苯二甲酸酯色譜峰峰形基本無影響，而甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液流動相體系會縮短色譜峰保留時間，但考慮到對保留時間影響較小且無明顯改善峰形作用，所以本試驗(yàn)選擇甲醇-水流動相體系。

表1 不同流動相體系對六種鄰苯二甲酸酯色譜峰保留時間的影響Tab.1 Effects of different mobile phase systems on chromatographic peaks retention time of six phthalates

圖3 不同流動相體系六種鄰苯二甲酸酯的色譜圖Fig.3 Chromatograms of six phthalates in different mobile phase systems

2.1.3 柱溫的確定

柱溫分別選擇25、30、35和40℃，考察不同柱溫對六種鄰苯二甲酸酯色譜峰保留時間和分離度的影響，結(jié)果表明：柱溫對保留時間影響顯著，提高溫度會使流動相黏度減小，促使六種鄰苯二甲酸酯色譜峰的保留時間提前，提高分析效率。但柱溫的升高對BBP和DBP分離度影響明顯，對DEHP、DNOP、DINP和DIDP的分離度基本無影響。隨著柱溫的升高，BBP與DBP的分離度逐漸降低，我們通常認(rèn)為當(dāng)分離度≥1.5時，表明兩個色譜峰實(shí)現(xiàn)了完全分離，當(dāng)柱溫為25℃時，BBP與DBP的分離效果最好，綜合考慮確定柱溫為25℃，結(jié)果見表2。

表2 柱溫對六種鄰苯二甲酸酯色譜峰保留時間和分離度的影響Tab.2 Effects of column temperature on chromatographic peaks retention time and resolution of six phthalates

2.2 方法線性關(guān)系及檢出限

以六種鄰苯二甲酸酯的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)為0.9962~0.9997。方法檢出限采用試劑空白添加標(biāo)準(zhǔn)溶液完成前處理步驟后進(jìn)行儀器分析，當(dāng)S/N=3時所對應(yīng)的濃度為方法檢出限，本方法的檢出限為1.87~8.92 mg/kg，結(jié)果見表3。

表3 鞋類產(chǎn)品中六種鄰苯二甲酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限Tab.3 Standard curves and detection limits of six phthalates in footwear

2.3 回收率與精密度

回收率采用基體標(biāo)準(zhǔn)加入法，選取4種不同材質(zhì)的鞋材作為基體，添加三個水平，分別為250、500、1000 mg/kg，每個水平平行測定7次，結(jié)果表明：回收率為90.5%~97.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%~6.9%，滿足日常檢測要求，結(jié)果見表4。

表4 鞋類產(chǎn)品中六種鄰苯二甲酸酯的回收率與精密度Tab.4 The recovery rate and precision of six phthalates in footwear

2.4 液相色譜法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定樣品的結(jié)果比較

通過上述對儀器分析條件的優(yōu)化，確定了最佳儀器分析條件。選取10種不同材質(zhì)的樣品添加六種鄰苯二甲酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中六種鄰苯二甲酸酯的含量均為1000 mg/kg，分別使用液相色譜法和國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 32440-2015中的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對10種加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，比較兩方法測定結(jié)果的區(qū)別，結(jié)果見表5。

由表5可以看出，液相色譜法測定結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的測定結(jié)果相對偏差為1.6%~5.4%，一致性較好，可以作為鞋類產(chǎn)品中六種鄰苯二甲酸酯的另一種檢測確證手段。

表5 液相色譜法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定樣品中六種鄰苯二甲酸酯含量的結(jié)果Tab.5 Simultaneous determination of six phthalates in samples by HPLC and GC-MS

3 結(jié)論

通過對液相色譜儀檢測器波長、流動相體系和柱箱溫度的優(yōu)化，確定了最佳儀器分析條件，六種鄰苯二甲酸酯濃度在10~100 μg/mL線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，方法檢出限為1.87~8.92 mg/kg，回收率90.5%~97.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.8%~6.9%，液相色譜法測定結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的測定結(jié)果相對偏差為1.6%~5.4%。試驗(yàn)結(jié)果表明：本方法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法相比不需要使用內(nèi)標(biāo)物即可完成準(zhǔn)確定量，并且無氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測DINP和DIDP時的簇峰現(xiàn)象，儀器分析時間短，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，適用于鞋類產(chǎn)品中六種鄰苯二甲酸酯的檢測。