水產(chǎn)膠原的制備工藝及自組裝性能研究進展

張軍濤，汪海波＊，徐麗明

（1.武漢輕工大學 化學與環(huán)境工程學院，湖北武漢430023；2.中國食品藥品檢定研究院，北京102629）

引言

典型的I型膠原（以下稱膠原）是一類具有長而堅韌的三螺旋結構的纖維狀、大分子蛋白質，由2條α1肽鏈和1條α2肽鏈相互纏繞形成，每條肽鏈均含有(Gly-X-Y)n重復氨基酸序列[1]。膠原因來源的廣泛性和良好的生物學性能而在組織工程和生物醫(yī)學材料等領域得到廣泛應用[2]。然而，隨著膠原應用領域的不斷拓展以及部分國家和地區(qū)的宗教文化限制，傳統(tǒng)的哺乳動物膠原已不能完全滿足應用需求，特別是近年來人畜共患疾?。ㄈ缈谔阋吆童偱２〉龋┑念l繁爆發(fā)，更使得哺乳動物膠原制品的生物安全性受到質疑[3]。因此，尋找新興膠原資源作為傳統(tǒng)哺乳動物膠原的替代品或補充品成為該領域的迫切需求。

中國是世界漁業(yè)大國，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展同步帶動水產(chǎn)加工業(yè)的壯大。水產(chǎn)加工過程中，有效利用部分只占其總體重的約25%，剩余的近75%被稱為廢棄物[4]。其中，30%部分（主要為魚皮、魚鱗、魚骨等）富含膠原成分，成為膠原制取的重要來源之一。特別值得注意的是，水產(chǎn)動物因在品種、棲息環(huán)境、習性等方面差異較大而具有比哺乳動物膠原更多樣化的結構和性能特征，從而為膠原產(chǎn)品的制備和應用創(chuàng)造了更大的選擇空間。近年來，國內外諸多學者圍繞水產(chǎn)膠原的制取方法、理化性質及其在生物醫(yī)學領域的應用開展了大量研究并取得一系列成果。已有部分綜述性文章針對水產(chǎn)天然活性膠原及其變性產(chǎn)物的制備和應用等進行回顧性分析[5]。本文著重針對近十年來水產(chǎn)動物源天然活性膠原（不包含明膠和肽等膠原變性產(chǎn)物）的制備方法、不同魚種和組織的膠原得率和自組裝性能研究進行系統(tǒng)性回顧和綜述，以期為關注該領域的研究人員提供參考。

1 水產(chǎn)膠原的提取純化

與哺乳動物膠原提取過程類似，水產(chǎn)膠原的提取過程一般包括選材、除雜、提取和純化等步驟，其關鍵在于最大限度的提高膠原得率、保障膠原純度以及分子結構和生物功能的完整性。水產(chǎn)膠原的提取操作一般在低溫條件（低于15℃）下進行，以免受熱變性。

1.1 預處理

魚皮、魚鱗和魚骨等原料中往往含有大量的非膠原類蛋白和一定量的脂質、多糖等成分，而魚鱗和魚骨中還含有大量的無機成分。因此，為了降低膠原提取純化過程的難度，需要對原料進行預處理，一方面盡可能的脫除非膠原成分，另一方面使原料中膠原組織結構松散而利于膠原提取。

1.1.1 雜蛋白和脂質的脫除

脫除雜蛋白一般采用堿性或鹽溶液，如氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉等，其中最常用的是氫氧化鈉。Liu等[6]以草魚皮為原料，研究了脫雜蛋白過程中氫氧化鈉濃度對所得膠原的影響，結果表明，高濃度氫氧化鈉會導致膠原纖維的不均勻溶脹，從而影響后續(xù)脫脂、提取過程。因此，宜用弱堿進行脫雜蛋白操作[7]。

脫脂一般采用可溶解脂質的有機溶劑，如醇和醚等。除最常用的叔丁醇外，其它醇類和非離子型脫脂劑也見諸報道，如Xu等[7]以南方鯰魚皮為原料，依次采用15%的異丙醇和非離子型脫脂劑處理，最優(yōu)脫脂率達90.24%。

傳統(tǒng)脫雜蛋白和脂質操作往往會產(chǎn)生大量堿液和有機廢液，從而污染環(huán)境。為了克服這一問題，有學者采用發(fā)酵法進行膠原提取的預處理操作。芽孢桿菌（Bacillus Velezensis FEL-BM21）是從凍土中分離得到的一種可以在低溫條件下分解脂肪和蛋白質的細菌。Song等[8]以羅非魚皮為原料，比較了芽孢桿菌發(fā)酵法和傳統(tǒng)方法進行預處理對膠原提取得率的影響。結果表明，發(fā)酵法所得酸溶性膠原（Acid-soluble collagen，ASC）和酶溶性膠原（Pepsin-soluble collagen，PSC）的產(chǎn)率略高于化學法。

1.1.2 色素的脫除

膠原一般為白色凍干海綿或粉末狀固體，而魚皮含有的色素會影響其外觀顏色。因此，為了獲得良好表觀質量的膠原，一般采用雙氧水或活性炭對魚皮原料進行脫色。其中，雙氧水可以破壞魚皮黑色素的發(fā)色基團而達到產(chǎn)品脫色的目的，效果優(yōu)于活性炭的物理吸附作用，因此，雙氧水是目前水產(chǎn)膠原脫色最常用的方法。Xu等[7]采用0.5%雙氧水處理南方鯰魚皮原料，改善了所得膠原的表觀性能。Liu等[9]采用雙氧水處理烏鱧魚皮脫色素的研究表明，膠原的提取得率及顏色和結構完整性與雙氧水的濃度和pH關系密切。

1.1.3 無機成分的脫除

魚鱗和魚骨中含有的大量羥基磷灰石成分，因與組織中的膠原成分緊密結合而增大膠原提取難度。因此，對于該類原料還需要進行脫鈣處理。常用的脫鈣試劑為乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA），也有學者嘗試用酸處理替代。Liu等[10]分別采用EDTA和鹽酸對羅非魚骨進行脫鈣處理，結果表明鹽酸的脫鈣速度較快，但會導致膠原得率變低，且會影響膠原三螺旋結構的完整性。

1.2 酸法提取膠原

游離態(tài)膠原易溶于酸，因此，一般采用酸性溶液提取膠原成分。值得注意的是，膠原在動物組織中存在游離態(tài)和纖維態(tài)兩種形式，而后者的比例會隨動物生長時間而逐漸提高。通常情況下，成年哺乳動物組織中游離膠原的含量較低，因此采用單一的酸法提取膠原的得率往往較低；而水產(chǎn)動物代謝較快，生長周期短，其體內游離態(tài)膠原含量遠高于哺乳動物，直接采用酸法提取即可獲得較高的得率[11]。

在酸法提取過程中，適量的酸會改變膠原分子表面的電荷密度，進而影響膠原分子間的靜電相互作用，并破壞分子間的氫鍵、席夫堿等相互作用，從而使得天然活性膠原溶于酸液中。酸法提取得到的膠原具有完整的三螺旋結構，且分子末端含有非螺旋的端肽結構，被稱為酸溶性膠原（ASC）。一般采用乙酸、甲酸、乳酸、鹽酸、檸檬酸、酒石酸等提取膠原，其中以乙酸最為常用。Skierka[12]以波羅的海鱈魚皮和雜交鱘魚皮為原料，比較了0.5 mol/L檸檬酸、乳酸、乙酸以及鹽酸對膠原提取效果的影響。結果表明，乙酸和乳酸的提取效果最好，鹽酸最差。

在酸法提取過程中，除了酸的種類具有重要影響外，酸的濃度、提取溫度和時間以及固液比、魚皮破碎程度等也會影響膠原得率。Menezes等[13]以羅非魚皮為原料，采用乙酸（固液比1/25）取ASC的研究表明，低酸濃度、高提取溫度和長提取時間有利于提高膠原得率。Sadowska等[14]采用乙酸從波羅的海鱈魚皮中提取ASC，研究表明在乙酸提取膠原的過程中固液比越低、魚皮破碎程度越高，提取效果越好。

除了傳統(tǒng)的無機酸和有機酸以外，超臨界流體技術等也被用于提取膠原。如Sousa等[15]采用二氧化碳增壓獲得的碳酸化水從大西洋鱈魚皮中提取膠原，以13.8%的得率得到ASC。

1.3 酸/酶法提取膠原

由于酸法無法提取交聯(lián)纖維狀態(tài)的膠原組分，因此，往往采用酶水解結合酸溶出的策略提高膠原得率。部分酶可以特異性切斷纖維狀態(tài)膠原分子兩端非螺旋區(qū)域（端肽）的共價鍵交聯(lián)而不影響其三螺旋結構，從而使得膠原轉變?yōu)橛坞x態(tài)并溶出[16]。此外，去除端肽還能有效降低膠原的免疫排斥缺陷，有利于其在組織工程領域的應用。酸/酶法提取得到的膠原具有完整的三螺旋且不含端肽結構，一般被稱為酶溶性膠原（PSC），常用的酶包括豬胃蛋白酶、水產(chǎn)源胃蛋白酶、植物源和真菌源酶等，其中以豬胃蛋白酶的應用最廣泛。Benjakul等[17]以兩種大眼鯛魚皮為原料，比較了金槍魚和豬胃蛋白酶對膠原提取的影響。結果表明，金槍魚胃蛋白酶的提取效率更高。Mizuta等[18]以真菌（Rhizopus niveus）酸性酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)的豬胃蛋白酶從菱鰭烏賊皮中提取膠原的研究表明，兩種酶具有類似的活性，膠原的得率無明顯差異。Nurilmala等[19]采用木瓜蛋白酶從黃鰭金槍魚皮中提取PSC，結果表明酶濃度越高，所得PSC的得率也越高。值得注意的是，酶的活性與溫度關系密切，在酶的最適溫度下進行膠原提取可以獲得較高的得率，但也可能導致膠原受熱變性。Aukkanit等[20]以銀線鱸魚皮為原料，研究了溫度對乙酸/胃蛋白酶法提取膠原得率和結構的影響。結果表明，10℃條件下膠原的得率最高；當溫度升至20℃和28℃時，則對膠原的結構和性能產(chǎn)生不利影響。

1.4 利用輔助手段提高膠原得率

超聲、勻質等輔助技術可以提高膠原的得率。Kim等[21]在乙酸提取海鱸魚皮膠原的過程中采用超聲輔助法提高了膠原的得率，而且能降低提取時間和酸的用量，但過度超聲會破壞膠原結構。Zou等[22]以甲魚鱉裙為原料提取膠原的過程中使用超聲輔助法，得率比傳統(tǒng)方法提高了16.3%，且不會影響膠原的三螺旋結構。而Karnjanapratum等[23]采用超聲輔助酸法提取七星刀魚皮膠原的研究表明，過度超聲雖然可以提高膠原得率，但是也會導致膠原降解而降低純度。Tan等[24]以斑點叉尾鮰魚皮為原料，研究了勻質輔助對膠原提取的影響，結果表明，勻質輔助可以將膠原得率由傳統(tǒng)法的42.36%提升到60.38%。與傳統(tǒng)的膠原純化方法相比，超濾、電滲析等技術可以提高膠原的純化效率。Chen等[25]采用酸/酶法提取紅鼓魚鱗膠原的過程中采用基于聚醚砜膜的親水超濾法分離純化產(chǎn)品，其效率遠高于傳統(tǒng)的透析法。Chen等[26]在酸法提取東方鲀魚皮膠原的過程中采用電滲析法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的透析法純化膠原，不僅可以提高膠原的得率，而且能減少純化時間和產(chǎn)生的廢水。

1.5 原料對膠原提取效果的影響

水產(chǎn)動物種類繁多，可作為膠原提取原料的種類也十分豐富，不同來源的水產(chǎn)原料，其膠原提取得率、結構、性能等均存在不同程度的差異（不同來源魚類和不同組織部位提取膠原的得率差異如表1所示）。即使同種類魚，由于棲息環(huán)境、生長時間以及不同提取組織部位等也會對膠原提取得率產(chǎn)生影響。Lee等[27]選用海水和淡水虹鱒魚為樣本，采用0.5 mol/L乙酸（固液比1/10）提取3 d分別以61.6%±0.2%和60.9%±0.1%的得率得到ASC，進一步研究表明，養(yǎng)殖環(huán)境（海水或淡水）對魚皮中膠原組成和性能無明顯影響。Pan等[28]以深海和淺海生長的圓眼燕魚皮為原料，采用0.5 mol/L乙酸和胃蛋白酶（0.1 mg/mL）提取24 h分別以52.38%和33.96%的得率得到PSC。對于同種魚的不同組織而言，其魚皮、魚鰭、魚鱗、魚骨中膠原含量依次降低[30]；為了獲得較高的膠原產(chǎn)率，可以依次采用酸法和酸/酶法對原料進行提取。如采用酸法提取魚皮原料中的ASC，產(chǎn)率在58.62%~4.7%之間；針對所得殘渣進一步采用酸/酶法再次提取，仍可以26.5%~6.5%的產(chǎn)率獲得PSC。

表1 不同來源魚類和不同組織部位提取膠原的得率差異Tab.1 The extracted yield of collagen from different fish and different tissues

2 水產(chǎn)膠原的自組裝性能調控

2.1 水產(chǎn)膠原自組裝監(jiān)測方法

在適宜的外界條件下，天然膠原通過分子間相互作用（氫鍵、靜電、疏水相互作用），可以自發(fā)有序聚集形成纖維狀產(chǎn)物，這一過程稱為自組裝，是膠原固有的分子行為特征（圖1）。所得膠原纖維的機械性能、熱變性溫度和耐酶降解性能等均優(yōu)于膠原單分子，因此，自組裝被廣泛應用于提高膠原基生物醫(yī)學材料的性能。

圖1 膠原自組裝及纖維產(chǎn)物示意圖。（a）膠原單分子；（b）膠原微纖維；（c）膠原纖維及其SEM圖（d）和TEM圖（e）Fig.1 Schematic of the self-assembly of collagen and the resulting fibrils

水產(chǎn)膠原自組裝的監(jiān)測方法主要有濁度法、流變學方法、熒光法和電鏡法等。自組裝過程中，膠原因聚集形成大尺度的纖維和網(wǎng)絡結構而導致體系透光率的變化。因此，通過紫外-可見分光光度計監(jiān)測體系透光率（濁度）的變化可以便捷表征膠原的自組裝行為。典型的膠原自組裝過程由成核期、快速增長期和平衡期三部分構成，其濁度曲線呈“S”型。在成核期，膠原分子聚集成核，是自組裝的關鍵步驟，濁度值無明顯變化；在快速增長期，膠原開始自組裝形成纖維和纖維網(wǎng)絡，濁度值快速升高；在平衡期，膠原的自組裝基本完成，濁度值不再變化。由于膠原自組裝形成的纖維網(wǎng)絡結構使得溶液體系轉化為凝膠體系，體系的粘性模量和彈性模量均會發(fā)生變化。因此，膠原自組裝過程還可以采用流變學方法進行監(jiān)測。該方法不僅可以揭示膠原自組裝的動力學過程，還可以表征所得凝膠產(chǎn)物的機械性能。

除了傳統(tǒng)的濁度法和流變學方法以外，某些特定熒光性物質，如芘、硫黃素T，因與膠原或膠原纖維的特異性結合而被用于膠原的自組裝行為監(jiān)測[38-39]。

2.2 水產(chǎn)膠原自組裝調控

溫度是膠原自組裝的關鍵因素。水產(chǎn)膠原自組裝的最適溫度往往低于哺乳動物膠原，如牛跟腱膠原一般在35~37℃條件下進行自組裝，而水產(chǎn)膠原的最適組裝溫度一般低于30℃[40]。除溫度外，膠原自組裝還受外環(huán)境因素的影響。Zhang等[41]采用流變學方法研究了膠原濃度、溫度、pH、離子強度等外環(huán)境因素，對其自組裝行為及所得凝膠產(chǎn)物機械性能的協(xié)同影響機制。

除常規(guī)環(huán)境影響因素外，外加分子和外力場以及端肽結構、三螺旋結構完整程度等也會對膠原自組裝產(chǎn)生影響。Zhang等[16]運用濁度和流變學方法開展了端肽對烏鱧皮膠原自組裝行為的影響研究，結果表明端肽的存在不僅可以提高膠原自組裝速率，而且可以提高所得凝膠產(chǎn)物的機械性能。Zhai等[42]研究了離子液體對草魚皮膠原自組裝行為的影響。離子液體會抑制膠原的自組裝行為，但可以提高所得產(chǎn)物的熱變性溫度和機械性能。Nan等[43]研究了超高壓對牛蛙皮膠原結構和性能的影響。結果表明，超高壓處理會使得膠原自組裝速率變慢，所得纖維產(chǎn)物的直徑增加。

受不同類型膠原雜化纖維的啟發(fā)，有學者在體外實現(xiàn)異源膠原共組裝，以期獲得良好性能的膠原基材料。如Wei等[44]將牛蛙皮膠原與豬皮膠原共混，分別采用濁度實驗和熒光淬滅實驗證實了異種膠原之間的共組裝行為。所得雜化纖維的直徑和D周期均小于單一膠原纖維產(chǎn)物；所得凝膠產(chǎn)物的機械性能也與單一膠原凝膠不同，但是共組裝并不會影響產(chǎn)物的生物相容性。

3 總結和展望

水產(chǎn)膠原具有良好的生物安全性和功能性等特點，而且原料豐富，來源廣泛，具有多樣性的結構和性能，因此，水產(chǎn)膠原有望成為極具前途的綠色可再生生物醫(yī)學材料。與此同時，水產(chǎn)加工廢棄物為具有高性價比的膠原提供了豐富的來源，從水產(chǎn)加工廢棄物中提取膠原不僅提高水產(chǎn)加工行業(yè)的附加值，而且能降低對環(huán)境污染的壓力。然而，也必須認識到水產(chǎn)膠原及其提取應用過程中的不足和缺陷：（1）水產(chǎn)動物種類繁多，不同魚種及組織中膠原含量及類型不同，需要進行進一步深入研究，以便為膠原原料的選擇提供指導；（2）水產(chǎn)膠原的制備工藝尚需進一步優(yōu)化，特別是針對色素、腥味等的去除方法以及大規(guī)模工業(yè)化制備工藝，如酸堿溶液的使用和排放等，進行深入探究，在保持膠原結構和性能的前提下，盡可能提高膠原的得率和品質；（3）水產(chǎn)膠原結構和自組裝性能之間的構效關系，以及與哺乳動物膠原相比的性能優(yōu)勢和不足仍需深入闡釋，以便為水產(chǎn)膠原的大規(guī)模臨床應用奠定基礎。因此，圍繞水產(chǎn)膠原仍需開展大量工作，如開發(fā)簡便、高效的活性膠原提取新工藝，有效降低活性膠原的提取成本，避免提取過程中產(chǎn)生的強酸和強堿等的使用及排放問題；深入挖掘水產(chǎn)膠原的功能特性，進一步拓寬水產(chǎn)膠原的應用領域等。