猴頭健胃靈片對(duì)功能性消化不良大鼠胃動(dòng)力、腦腸肽和c-kit的影響

孫夢(mèng)云 張聲生 宋 瑾 王天園 郝家琪 王瑞昕

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京,100029; 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京,100010)

功能性消化不良(Functional Dyspepsia,FD)是指餐后飽脹、早飽、上腹痛和上腹部燒灼感等癥狀中的一種或者多種的一組臨床綜合征[1]。FD是世界范圍內(nèi)常見的功能性胃腸病之一,全球總患病率為11.5%～14.5%[2],亞洲國(guó)家在8%～23%之間[3]。雖然FD是非器質(zhì)性疾病,但其病程長(zhǎng)、易反復(fù),調(diào)查發(fā)現(xiàn)FD患者生命質(zhì)量嚴(yán)重下降[4]。FD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明,缺乏特效藥,因此探究FD的發(fā)病機(jī)制以及尋找有效的治療手段已經(jīng)成了臨床醫(yī)師和科研人員亟待解決的科學(xué)問題。FD是中醫(yī)的優(yōu)勢(shì)病種,中醫(yī)認(rèn)為情志失調(diào)是本病的主要病因,肝胃不和是重要病機(jī),肝失疏泄,橫逆犯胃,以致氣機(jī)升降失常,治當(dāng)理氣解郁,和胃降逆[5]。猴頭健胃靈片由猴頭菌絲體、海螵蛸、醋延胡索、酒白芍、醋香附、甘草等組成,有疏肝和胃、理氣止痛的功效。臨床研究證實(shí),猴頭健胃靈治療FD,在總有效率、緩解癥狀積分及改善生命質(zhì)量等方面,均優(yōu)于莫沙必利對(duì)照組[6-7],但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

胃動(dòng)素(Motilin,MTL)是一種能促進(jìn)胃竇收縮,加速胃排空的腦腸肽,研究表明FD患者M(jìn)TL分泌減少,使胃平滑肌收縮減弱或Ⅲ期收縮缺乏,進(jìn)而導(dǎo)致胃排空延長(zhǎng)[8]。膽囊收縮素(Cholecystokinin,CCK)是能延緩胃排空、抑制攝食、促進(jìn)膽囊收縮及誘發(fā)飽脹感等作用的腦腸肽,研究發(fā)現(xiàn)其與FD患者的餐后飽脹不適和早飽的癥狀密切相關(guān)[9]。最近的研究證實(shí)位于肌間神經(jīng)叢的腸肌間卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞(Myenteric Interstitial Cells of Cajal,ICC-MY)的過度自噬和異常分化可能是導(dǎo)致FD胃動(dòng)力障礙的機(jī)制之一[10]。中醫(yī)藥治療FD的相關(guān)研究均發(fā)現(xiàn),通過中藥或針灸的干預(yù),FD患者血漿中的MTL、CCK水平升高,胃肌間神經(jīng)叢ICC的標(biāo)志物c-kit表達(dá)上調(diào)[13-14]。以上研究提示,MTL、CCK及ICC的表達(dá)水平,既是FD發(fā)病的重要環(huán)節(jié),又是治療的靶點(diǎn)。本研究旨在在探討猴頭健胃靈片對(duì)FD大鼠胃動(dòng)力的作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 30只無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量220～250 g,每籠5只,底鋪玉米芯墊料,動(dòng)物的飼養(yǎng)完全按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利許可,在室溫條件下,24 h滅菌飼料和飲用水供應(yīng),正常晝夜更替的光照。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)開始前先適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境7 d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供(許可證號(hào)SYXK京2018-0006)。所有實(shí)驗(yàn)程序符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)制定的準(zhǔn)則,且經(jīng)過北京中醫(yī)研究所動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2020060104)。

1.1.2 藥物 猴頭健胃靈片(主要由猴頭菌絲體、海螵蛸、醋延胡索、酒白芍、醋香附、甘草等組成)(湖南新匯制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090592)。按照人與動(dòng)物等效劑量換算系數(shù),制作濃度為24 mg/mL的含藥水溶液。實(shí)驗(yàn)用異氟烷(北京友誠(chéng)嘉業(yè)生物科技有限公司，批號(hào):045742)(誘導(dǎo)麻醉濃度2%、維持麻醉濃度1.5%)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠MTL、CCK酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司,貨號(hào):CEA575Ra、CEA802Ra);c-kit多克隆抗體(Santa Cruz，美國(guó),貨號(hào):sc-365504),石蠟切片機(jī)(Leica公司,德國(guó),型號(hào):RM2255)、顯微鏡(Carl Zeiss公司,德國(guó),型號(hào):Axio Scope A1)、石蠟包埋機(jī)(Leica公司,德國(guó),型號(hào):EG1150C)、攤片機(jī)(Leica公司,德國(guó),型號(hào):HI1210)、高通量組織研磨儀(深圳信儀測(cè)控技術(shù)有限公司,型號(hào):Scientz-48)、多功能酶標(biāo)儀(BioTek公司,美國(guó),型號(hào):Synergy H1)、電子恒壓器及Protocol Plus Deluxe數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)(G&J Electronics公司,加拿大，型號(hào)：9.6R)、Powerlab放大器(ADI公司,澳大利亞,型號(hào):ML 0146/25-220)、四通道高效記錄儀(ADI公司,澳大利亞,型號(hào):PL 3508-0028)、張力換能器(ADI公司,澳大利亞,型號(hào):MLT 02021D)、數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)(ADI公司,澳大利亞,型號(hào):PowerLab/4SP)、超級(jí)恒溫槽(上海越平科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):CH-1015)、電子分析天平(上海菁海儀器有限公司,型號(hào):Y211407011)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、猴頭健胃靈組,每組10只。參照文獻(xiàn)[15]的方法對(duì)模型組和猴頭健胃靈組采用夾尾刺激法進(jìn)行FD造模。每5只大鼠同籠,用長(zhǎng)海綿鉗夾大鼠尾巴遠(yuǎn)端1/3處,以不破皮為度,令其暴怒,與其他大鼠撕打,進(jìn)而激怒全籠大鼠。每次連續(xù)不斷地刺激30 min,隨著打斗的加劇,大鼠可能被抓傷,為避免炎癥干擾,用0.15%聚維酮碘涂擦受傷部位控制感染。4 h刺激1次,3次/d,實(shí)驗(yàn)周期安排避免干擾大鼠的生物節(jié)律。

1.2.2 給藥方法 連續(xù)刺激7 d后,猴頭健胃靈組予以猴頭健胃靈片含藥水溶液(24 mg/mL)1 mL/100 g灌胃治療;空白組與模型組以等體積的純水灌胃,1次/d,持續(xù)灌胃7 d。灌胃期間仍予以?shī)A尾刺激。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)胃排空率檢測(cè):實(shí)驗(yàn)前將空白組、模型組和猴頭健胃靈組分別分裝,每只鼠籠1只大鼠,禁食24 h。每只動(dòng)物分別自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)維持鼠糧,1 h后撤食。2 h后,過量麻醉處死動(dòng)物,沿腹中線剖開腹腔,結(jié)扎胃幽門和賁門,取出胃。將胃內(nèi)容物取出并烘干稱重,計(jì)算胃內(nèi)殘留物占所進(jìn)食的重量百分比為胃內(nèi)殘留率。胃排空(Gastric Emptying,GE)率的計(jì)算公式為:GE(%)=(1-胃內(nèi)殘留食物重量/攝取食物重量)×100%。胃排空率測(cè)定后剩余的胃組織放入4%多聚甲醛中固定用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。2)離體胃平滑肌條張力檢測(cè):灌胃結(jié)束后,按照本課題組以前發(fā)表的論文中描述的方法,采用器官灌流裝置和張力換能系統(tǒng)對(duì)各組大鼠進(jìn)行離體胃肌條動(dòng)力測(cè)定[16]。將大鼠預(yù)先禁食24 h,自由飲水。使用2%異氟烷誘導(dǎo)麻醉后,將其水平置于大鼠固定板上,通過面罩持續(xù)給予1.5%異氟烷維持麻醉,腹主動(dòng)脈采血、收集血漿后備用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)MTL和CCK濃度。切開腹部,快速取出胃體,用K-H(Krebs-Henseleit)緩沖液沖洗胃內(nèi)容物,沿著胃大彎處剪開,黏膜層朝上平鋪于硅膠上,在體視鏡下用顯微剪小心剪去黏膜及黏膜下層,整個(gè)操作過程均在冰上完成。將平滑肌層沿縱行肌剪成1～2 mm寬,9～11 mm長(zhǎng)的肌條,用外科縫線在肌條的兩端結(jié)扎,一端固定在浴槽的底部,另一端懸掛于壓力換能器。肌條置于盛有恒溫(37±0.5)℃、持續(xù)通氣(95%O2與5%CO2)5 mL的K-H緩沖液里內(nèi)。給肌條施加1 mN的靜息張力后,使其在水浴中平衡30 min左右,待基線穩(wěn)定后開始觀察記錄其收縮曲線。肌條動(dòng)力指數(shù)根據(jù)按收縮曲線下與時(shí)間的積分求得。3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血漿MTL、CCK含量:使用武漢云克隆科技股份有限公司生產(chǎn)的MTL、CCK酶聯(lián)免疫試劑盒和美國(guó)BioTek公司生產(chǎn)的Synergy H1多功能酶標(biāo)儀(H1M),按照說明書的步驟進(jìn)行血漿中MTL和CCK含量的檢測(cè)。4)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃組織c-kit表達(dá):將固定好的胃組織脫水、石蠟包埋,切成厚度4 μm的薄片,放入45 ℃恒溫箱中烘干,用二甲苯溶液脫去組織切片中的石蠟,后依次浸泡入高濃度到低濃度的乙醇中,最后放入蒸餾中浸泡。將切片放入檸檬酸鈉溶液中,98～100 ℃抗原修復(fù),10 min后自然冷卻,后放入磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)沖洗3次,3 min/次。每個(gè)組織加1滴3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,避光10 min后放入PBS沖洗3次。每個(gè)組織滴5%BSA1～2滴,封閉20 min。小鼠源c-kit多克隆抗體稀釋液(1∶100)4 ℃孵育過夜,PBS沖洗3次后,每個(gè)組織滴辣根過氧化物酶標(biāo)抗鼠聚合物1滴,室溫孵育20 min,PBS沖洗3次。新鮮配制的DAB工作液染色7 min后,流水沖洗后經(jīng)蘇木精復(fù)染、各級(jí)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后使用顯微鏡拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量及胃排空率 在造模過程中,空白組大鼠精神良好,活動(dòng)靈敏;模型組大鼠隨著造模進(jìn)程逐漸出現(xiàn)進(jìn)食量減少、毛發(fā)枯萎。模型組大鼠24 h固體食物攝入量與空白組大鼠比較顯著減少(P<0.05)、體質(zhì)量顯著減輕(P<0.001);猴頭健胃靈組大鼠在服用藥物后,精神狀態(tài)逐漸恢復(fù),固體食物攝入量增多(P<0.05)、體質(zhì)量顯著增加(P<0.001)。模型組大鼠固體食物胃排空率與空白組比較有降低趨勢(shì),猴頭健胃靈治療的大鼠胃排空率顯著高于空白組和模型組大鼠。見表1。

2.2 胃平滑肌動(dòng)力 模型組大鼠胃離體平滑肌的收縮幅度與空白組比較顯著下降,動(dòng)力指數(shù)顯著低于空白組(P<0.05);猴頭健胃靈可以促進(jìn)大鼠胃離體平滑肌的收縮幅度,顯著提高動(dòng)力指數(shù)(P<0.01)。見圖1,表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量及胃動(dòng)力指標(biāo)

2.3 血漿MTL和CCK水平 與空白組比較,模型組大鼠血漿MTL、CCK的含量顯著下降(P<0.05);而猴頭健胃靈組大鼠血漿中MTL和CCK的水平與FD比較顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清MTL和CCK的水平

2.4 胃c-kit免疫陽性的表達(dá) ICC的標(biāo)志物c-kit分布在胃平滑肌全層均有分布,其中環(huán)形肌和縱行肌的肌束中分布較少,而肌間神經(jīng)叢則分布較多;與空白組和模型組比較,猴頭健胃靈觀察組大鼠胃肌間神經(jīng)叢中c-kit免疫陽性細(xì)胞顯著增多。見圖2。

3 討論

MTL是近端小腸M細(xì)胞分泌的一種腦腸肽,能促進(jìn)胃竇收縮、加速胃排空,調(diào)控?cái)z食與情緒,具有饑餓信號(hào)的功能[17]。眾所周知,MTL的水平是隨著消化間期胃移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)(Migrating Motor Complex,MMC)的周期波動(dòng)的,在Ⅲ相收縮期是最高[17]。臨床研究發(fā)現(xiàn),在FD胃排空延遲的患者中,血漿MTL水平在消化間期和Ⅲ相收縮期出現(xiàn)異常波動(dòng)[18]。一種新型的小分子MTL受體激動(dòng)劑,可以在饑餓狀態(tài)下誘導(dǎo)胃Ⅲ相收縮期收縮,并劑量依賴性地促進(jìn)胃排空[19],該藥目前處于二期臨床試驗(yàn)階段。Liang等[20]通過饑餓、懸尾、激怒和強(qiáng)迫游泳的方法制作FD大鼠模型,當(dāng)模型大鼠出現(xiàn)胃腸動(dòng)力障礙時(shí),其血漿中的MTL和CCK水平顯著低于空白組。一項(xiàng)針刺治療FD的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),針刺足三里、梁門、太沖等穴位不但可以顯著降低FD患者的癥狀積分,還可以顯著升高患者血漿的MTL含量[21]。另一項(xiàng)采用束縛應(yīng)激所致FD大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn),蒼術(shù)精油可以顯著促進(jìn)FD大鼠的胃排空,并升高血漿MTL的水平[22]。本研究發(fā)現(xiàn)夾尾刺激所致的FD大鼠模型出現(xiàn)體質(zhì)量下降、胃排空延遲及離體胃動(dòng)力減弱,血漿MTL及CCK水平均下降,經(jīng)猴頭健胃靈治療后,體質(zhì)量上升、胃排空率增加、離體胃動(dòng)力增強(qiáng),同時(shí)血漿MTL及CCK水平升高。本研究與臨床及基礎(chǔ)研究結(jié)果基本一致,但由于MTL的水平會(huì)隨著胃MMC的周期產(chǎn)生波動(dòng),而本研究中血漿MTL的水平并未根據(jù)MMC的分期進(jìn)行測(cè)定,因此具有一定的局限性。

CCK是一種小腸上段Ⅰ型細(xì)胞釋放的腦腸肽,在食物攝入后尤其是在含有高脂肪或蛋白質(zhì)的餐后大量釋放[23]。在幽門螺桿菌感染相關(guān)的FD患者中,與幽門螺桿菌陰性患者比較,CCK的基礎(chǔ)值顯著降低[24]。對(duì)健康志愿者輸入CCK可以增強(qiáng)胃的順應(yīng)性,但遺憾的是這項(xiàng)研究并未在FD患者的身上得到證實(shí)[25],目前CCK受體激動(dòng)劑用于治療FD尚未進(jìn)入臨床試驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，猴頭健胃靈治療FD模型大鼠1周后,觀察組大鼠血清中CCK含量顯著高于模型組。這可能是猴頭健胃靈促進(jìn)FD大鼠胃動(dòng)力的機(jī)制之一。

已經(jīng)證明,ICC是胃腸道的起搏器細(xì)胞,起搏細(xì)胞電位通過ICC或ICC和平滑肌肉之間的間隙結(jié)傳遞給附近的細(xì)胞。因此,ICC對(duì)胃腸動(dòng)力的影響至關(guān)重要,其結(jié)構(gòu)及功能的異常又與多種胃腸動(dòng)力障礙疾病密切相關(guān)[26]。Hayashi等[27]研究發(fā)現(xiàn),高血糖可以通過c-kit的表達(dá)增加,從而導(dǎo)致胃排空加快,該研究提示我們,ICC表達(dá)的上調(diào)可能是導(dǎo)致部分患者胃排空加快的原因。而Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)FD大鼠模型的ICC-MY中細(xì)胞自噬的標(biāo)志物Beclin1和LC3B表達(dá)上調(diào),而細(xì)胞分化的標(biāo)志物c-kit和干細(xì)胞因子的下調(diào),提示FD大鼠的胃排空延遲可能與ICC-MY的過度自噬和異常分化導(dǎo)致的胃動(dòng)力障礙有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),FD模型大鼠ICC分化的標(biāo)志物c-kit的表達(dá)水平與空白組比較無明顯變化,然而猴頭健胃組大鼠胃c-kit表達(dá)水平顯著上調(diào),提示我們猴頭健胃靈片可能通過調(diào)控ICC的分化,進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)胃動(dòng)力的作用。