基于多酚質(zhì)量傳遞規(guī)律視角下的余甘子質(zhì)量標準研究思路

仇 敏 謝慧娟 羅傳紅 李格菲 張定堃 樊三虎 黃浩洲 林俊芝

(1 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)研究院,西南特色中藥資源國家重點實驗室,成都,611137; 2 成都市三勒漿藥業(yè)集團四川華美制藥有限公司,成都,610045; 3 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,代謝性疾病中醫(yī)藥調(diào)控四川省重點實驗室,成都,610072)

余甘子是大戟科葉下珠屬落葉小喬木余甘子PhyllanthusemblicaL.的成熟果實,是我國西南地區(qū)特色藥食同源品種。具有清熱涼血,消食健胃,生津止咳等功效。主要用于治療血熱血瘀、消化不良、腹脹、口干、咳嗽[1]。余甘子風(fēng)味獨特,初食苦澀,回味甘甜,富含維生素C、礦物質(zhì)、微量元素、氨基酸等活性物質(zhì),營養(yǎng)豐富,保健功能顯著,在降糖、調(diào)節(jié)血脂代謝、預(yù)防牙齦炎等方面作用突出[2]。目前,以余甘子入藥的中成藥近80種,相關(guān)專利(中國)超過3 000項[3],在食品藥品、保健品、化妝品等行業(yè)應(yīng)用廣泛,其經(jīng)濟、社會、生態(tài)多重價值及影響力逐年攀升。

多酚(鞣質(zhì))類成分是余甘子的主要活性成分,也是余甘子質(zhì)控的重要指標,但余甘子中鞣質(zhì)類成分化學(xué)性質(zhì)并不穩(wěn)定,易于發(fā)生水解氧化等反應(yīng),而沒食子酸、鞣花酸等是其鞣質(zhì)水解終產(chǎn)物之一[4]。由于余甘子多酚這種易于轉(zhuǎn)化的特性,導(dǎo)致其在貯藏加工乃至檢測過程中,以沒食子酸為主的指標性成分含量不斷變化。因此,2020年版《中華人民共和國藥典》及各地方標準,以沒食子酸含量為評控指標難以標準其質(zhì)量,主要存在以下3個問題。首先,單以沒食子酸缺乏特征性與專屬性,如五倍子、拳參、藍布正等均以此為含測指標。而沒食子鞣質(zhì)如柯里拉京等,具有較強生物活性[5],卻并未作規(guī)定。其次,沒食子酸是水解鞣質(zhì)中沒食子鞣質(zhì)的苷元,在加熱條件下藥材沒食子酸增加。2020年版《中華人民共和國藥典》以回流法制備供試品,會導(dǎo)致所測得的沒食子酸含量明顯偏高,難以準確評價藥材質(zhì)量。最后,余甘子中的沒食子酸的含量限度值得商榷。余甘子藥材中沒食子酸的含量會隨著貯藏加工逐步增加,但鞣質(zhì)類活性成分含量隨之降低[6]。因此,如何制定沒食子酸含量限度,如何更加全面評價其質(zhì)量,還需進一步探討。為此,本文基于余甘子多酚質(zhì)量傳遞規(guī)律,結(jié)合余甘子目前應(yīng)用現(xiàn)狀及現(xiàn)有余甘子各國各地方標準,對余甘子質(zhì)量標準研究思路與制定進行探討。

1 余甘子基源及資源分布

余甘子始載于晉代《南方草木狀》[7]稱庵摩勒,書中描述了余甘子植物具有“葉細似合昏”“花黃”“青黃果實似李”及“核圓作六七棱”的植物性狀。在北魏時,有將余甘子和橄欖視為同物的現(xiàn)象,到明代《本草綱目(下冊)》[8]載:“狀如川楝子,味類橄欖”,并指出“橄欖形長尖,余甘形圓,稍有不同,葉形亦異,蓋二物也?！?由此可知,余甘子和橄欖的植物形狀和功用在明代已得到較明確的區(qū)分。清代《植物名實圖考》[9]對余甘子枝葉和果實的描繪與P.emblicaL.的性狀特點吻合,由此確定余甘子藥材基原為大戟科葉下珠屬植物余甘子P.emblicaL.的果實。

余甘子是常見的散生樹種,適應(yīng)性強,多種環(huán)境下均能生長,被譽為造林先鋒樹種[10]。余甘子在我國東南沿海及西南等地區(qū)廣泛分布,野生資源主要分布在我國云南省、廣西壯族自治區(qū)南部和西南部地區(qū)、貴州省南部和四川省西南部區(qū)域。其中,云南省是最主要的余甘子野生資源分布區(qū)域[11]。廣西、廣東、福建地區(qū)多栽培,其中福建全省的資源蘊藏量大約為23萬畝[12]。

2 余甘子中主要活性成分

2.1 多酚類 余甘子含有多種酚類成分,鞣質(zhì)類成分主要有訶黎勒酸、柯里拉京、訶子次酸和訶子酸等,酚酸類成分主要有沒食子酸、鄰苯三酚、沒食子酸酯等。陳靜等[13]采用流式細胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn),以訶黎勒酸和柯里拉京為主的鞣質(zhì)能發(fā)揮抗腫瘤作用。訶黎勒酸能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的凋亡[14]。郭志英等[15]提出原訶子酸、柯里拉京、沒食子酸、鞣花酸等成分具有良好的降血糖活性。范源等[16]通過臨床試驗和動物試驗,證實沒食子酸的降血脂功效。余甘子中多酚和黃酮類化合物能夠?qū)挂掖颊T導(dǎo)的肝線粒體功能障礙以及酶和非酶抗氧化水平和肝結(jié)構(gòu)的改變,發(fā)揮保肝作用[17]。見圖1。

2.2 黃酮類 余甘子中含有多種黃酮類成分,主要有槲皮素、兒茶素、沒食子兒茶素、蘆丁、表兒茶素等。馬美等[18]和吳登攀等[19]研究發(fā)現(xiàn),余甘子的提取物、總黃酮均可抑制乳腺癌細胞的增殖。宋琳琳等[20]發(fā)現(xiàn)余甘子總黃酮對大鼠的佐劑性關(guān)節(jié)炎有一定的干預(yù)作用?？仔憔甑萚21]通過建立小鼠肺部炎癥病理模型,發(fā)現(xiàn)余甘子總黃酮具有較好地抑制甲型H1N1流感病毒的作用。見圖1。

2.3 萜類及甾醇類 余甘子中含有多種萜類及甾醇類化合物,如葉綠素及其衍生物、β-谷甾醇等。曾煦欣等[22]通過研究小鼠的扭體和耳郭腫脹實驗,結(jié)果顯示具有抗炎鎮(zhèn)痛作用的物質(zhì)主要為沒食子酸、槲皮素和β-谷甾醇。張玉潔[23]研究發(fā)現(xiàn)余甘子枝葉中異柯里拉京和羽扇豆醇對病毒抑制效果好。見圖1。

2.4 多糖類 余甘子各器官皆含有多糖類化合物[24]。鄭寶東和曾紹校[25]采用鄰苯三酚自氧化法和DTNB比色法,發(fā)現(xiàn)余甘子多糖提取物具有抗氧化活性。曹莉莉等[26]采用比濁法發(fā)現(xiàn),余甘子多糖具有抑菌活性及群體感應(yīng)抑制活性。王銳[27]采用體外化學(xué)模型,研究表明余甘子多糖對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶有抑制活性。見圖1。

2.5 其他營養(yǎng)物質(zhì) 余甘子果實中富含維生素C、礦物質(zhì)硒及鋅、鈣等16種微量元素,18種氨基酸,具有提高血紅蛋白的含量、降低耗氧量、抗氧化、抗疲勞等作用[28]。

3 余甘子干燥-貯存-提取過程中多酚(鞣質(zhì))的質(zhì)量傳遞規(guī)律

多酚(鞣質(zhì))類成分是余甘子的主要活性成分,也是余甘子質(zhì)控的重要指標。研究發(fā)現(xiàn),不同批次、來源的余甘子化學(xué)指紋圖譜相似度低,不同批次余甘子藥材色譜圖的相似度低,沒食子酸和鞣花酸等指標性成分含量差異極大,往往高達數(shù)十倍(2.03～31.83 mg/g和4.34～39.39 mg/g)直接導(dǎo)致其藥理活性差異顯著[29-30]。不同的加工過程會使余甘子中沒食子酸、鞣花酸、柯里拉京、訶黎勒酸差異明顯[31]。如余甘子鹽炙過程中不同加水量、鹽比例及炮制溫度對其成分含量影響明顯[32]。研究發(fā)現(xiàn),余甘子中鞣質(zhì)類成分化學(xué)性質(zhì)并不穩(wěn)定,易于發(fā)生水解、氧化等反應(yīng),例如在加熱過程中,訶黎勒酸中的酯鍵發(fā)生斷裂,水解生成柯里拉京與訶子次酸,柯里拉京中酯鍵斷裂后可水解形成鞣花酸、沒食子酸與葡萄糖,而鞣花酸因低溶解度生成沉淀[33]。

余甘子質(zhì)量差異的形成原因與影響因素可大致歸納為生物效應(yīng)、微生物效應(yīng)與熱效應(yīng)。不同的立地條件促使余甘子中多酚類成分含量差異明顯,線狀真菌、酵母、細菌等多種微生物分泌的單寧酶易使鞣質(zhì)酯鍵斷裂產(chǎn)生復(fù)雜的中間產(chǎn)物及小分子化合物。在余甘子干燥,炮制加工,貯藏等過程中伴隨的大量加熱過程,致使余甘子中的多酚成分的氧化、水解、聚合等反應(yīng)持續(xù)進行,沒食子酸、鞣花酸等小分子終產(chǎn)物含量不斷變化。見圖2。因此,僅以沒食子酸為指標,難以準確有效評價其質(zhì)量。

4 余甘子質(zhì)量標準與炮制規(guī)范

4.1 余甘子質(zhì)量標準比較分析 我國余甘子應(yīng)用形式多樣,《中華人民共和國藥典》《香港中藥材標準》《藏藥標準》《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準》所收載的為余甘子干燥果實,余甘子是少數(shù)民族習(xí)用藥材,但藏藥與壯藥標準缺少了對余甘子質(zhì)量的相關(guān)評價,只有《中華人民共和國藥典》與《香港中藥材標準》對余甘子指標成分進行了定性定量檢測,測定指標分別為沒食子酸、沒食子酸與鞣花酸總量。福建與廣東傾向于余甘子鮮用,關(guān)注了維生素C與鞣質(zhì)的含量?！队幍洹放c《印度藥典》收載的余甘子應(yīng)用形式為余甘子的去核果肉,課題組前期實驗發(fā)現(xiàn),余甘子果核多酚類成分豐度以及抗氧化活性遠小于果肉,建議將余甘子果肉與不去核果實分為2種商品規(guī)格[34]。英國與印度含量測定對鞣質(zhì)總量進行了相關(guān)規(guī)定,現(xiàn)行余甘子標準含量測定皆是將鞣質(zhì)類成分作為余甘子的指標成分。見表1。

表1 余甘子質(zhì)量標準比較

4.2 各版各地方中藥飲片炮制規(guī)范比較分析 經(jīng)查閱《中華人民共和國藥典》及各版各地方中藥飲片炮制規(guī)范,《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》中記載余甘子炮制方式為取原藥材,除去雜質(zhì),篩去碎屑[35]?！吨貞c市中藥飲片炮制規(guī)范及標準》中記載炮制方式為除去雜質(zhì),洗凈,干燥[36]?！陡＝ㄊ≈兴庯嬈谥埔?guī)范》中記載藥用部位為余甘子樹皮,炮制方式為除去雜質(zhì),洗凈,燜潤,切絲,曬干[37]?！逗鲜≈兴庯嬈谥埔?guī)范》中記載炮制方式為取原藥材,除去雜質(zhì),干燥[38]?！端拇ㄊ≈兴庯嬈谥埔?guī)范》中記載炮制方式為取余甘子鮮果,洗凈,切成片狀或塊狀,低溫或真空干燥[39]。《甘肅省中藥炮制規(guī)范》中記載炮制方式為取原藥材,除去雜質(zhì),揀去腐爛變質(zhì)者,篩去灰屑。如用于配制軟膏劑時,要除去核[40]。《內(nèi)蒙古蒙藥飲片炮制規(guī)范》中記載炮制方式為取原藥材,除去雜質(zhì),藥用余甘子粉則取凈余甘子,研細粉,過篩,即得[41]。各省市的余甘子炮制方法存在較大差異,炮制后余甘子的活性成分也明顯不同,但在《中華人民共和國藥典》以及各省市炮制規(guī)范中卻并未對余甘子炮制工藝參數(shù)與炮制質(zhì)量標準進行相關(guān)規(guī)定,余甘子炮制存在記載不一,且炮制標準缺失的問題等。

5 我國余甘子現(xiàn)行質(zhì)量標準存在的問題及探討

比較現(xiàn)行余甘子質(zhì)量標準與藥理研究可知,多酚(鞣質(zhì))類成分是余甘子最主要的活性成分與指標成分,但其在干燥、炮制、貯藏、提取過程等環(huán)節(jié)易發(fā)生水解、氧化、聚合等反應(yīng),沒食子酸、鞣花酸等小分子終產(chǎn)物含量持續(xù)變化,現(xiàn)行標準僅對余甘子中的沒食子酸進行測定存在問題。

5.1 含量測定指標有待商榷 2020版《中華人民共和國藥典》中,余甘子含量檢測項下規(guī)定余甘子按干燥品計算,沒食子酸含量不得少于1.2%,這一指標的選擇及限度值得商榷。沒食子酸在富含鞣質(zhì)的藥材中普遍存在,如《中華人民共和國藥典》中委陵菜、拳參、藍布正等均以此為含量測定指標,單以沒食子酸作為余甘子含量測定指標缺乏特征性與專屬性,難以標準其品質(zhì)。此外,余甘子中含有大量沒食子鞣質(zhì),它們水解后能形成沒食子酸,是沒食子酸的持續(xù)來源。在余甘子中,沒食子酸分子可分為游離沒食子酸和形成鞣質(zhì)部分的非游離沒食子酸。不難發(fā)現(xiàn),《中華人民共和國藥典》及地方標準中,希望測定的是游離沒食子酸,但不少地方標準要求余甘子飲片以鮮果切片凍干形式生產(chǎn),此時沒食子酸主要以非游離形式存在,其游離的沒食子酸含量難以達到《中華人民共和國藥典》等規(guī)定的1.2%要求。此外,依據(jù)《中華人民共和國藥典》方法加熱回流提取余甘子供試品制備過程中會導(dǎo)致沒食子酸的含量偏高[4]。可見,《中華人民共和國藥典》方法測得的沒食子酸實際上包含了沒食子鞣質(zhì)所水解釋放的沒食子酸。因此,若想規(guī)避這一問題,只能在制備方法中盡量避免沒食子鞣質(zhì)的水解。

然而,僅僅測定余甘子中天然存在的沒食子酸也存在不足之處。研究發(fā)現(xiàn),除了在藥材提取階段,余甘子藥材在貯藏過程中,受環(huán)境和微生物等因素的影響,鞣質(zhì)類成分也會不斷分解形成沒食子酸。這意味著對于余甘子而言,無論何時,沒食子酸的釋放是持續(xù)進行的?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),余甘子中的沒食子鞣質(zhì)也具有明確的藥效與生物活性,具有抗氧化、抗菌、抗病毒與抗腫瘤等作用。因此,可以推斷,余甘子的質(zhì)量評價,還需要考慮還未水解成沒食子酸的鞣質(zhì)部分,即余甘子的質(zhì)量評價應(yīng)綜合測定游離沒食子酸和非游離沒食子酸(可水解生成沒食子酸的鞣質(zhì))。在《香港中藥材標準》中,以沒食子酸與鞣花酸作為質(zhì)控指標,但鞣花酸同為水解鞣質(zhì)中鞣花鞣質(zhì)的苷元,也存在上述類似情況。因此,無論以沒食子酸或鞣花酸作為余甘子的含測標準,都存在合理性不足的問題。

5.2 檢測手段有待提高 目前,隨著檢測技術(shù)的快速發(fā)展,關(guān)于植物中沒食子鞣質(zhì)和沒食子酸的定性定量及快速檢測方法發(fā)展十分迅速。本文篩選出以下幾種方法供參考,主要可分為水解法和光化學(xué)法等評價方法。水解法可參考同樣以沒食子酸為含量測定指標物質(zhì)的多酚類藥材五倍子。2020版《中華人民共和國藥典》中五倍子的含量測定項下[1],在供試品溶液制備過程中,指出采用強酸性環(huán)境下充分加熱水解3.5 h后測定沒食子酸含量,以此可測定出余甘子藥材中總共可以釋放出的沒食子酸含量,即為游離沒食子酸與非游離沒食子酸的總量。運用甲醇短時間超聲提取余甘子進行含量測定,可抑制鞣質(zhì)的水解,較準確地測定出游離沒食子酸的含量[4],而非游離沒食子酸為二者差值,此方法具有操作簡單,準確度高,對操作人員和儀器設(shè)備要求相對較低等優(yōu)點,適用于《中華人民共和國藥典》方法檢測。

水解法雖原理簡單、可操作性強,但伴隨著較長時間的前處理,難以實現(xiàn)快速檢測的需求。沒食子酰基是沒食子鞣質(zhì)與沒食子酸共有結(jié)構(gòu),其具有鄰苯三酚這一特征結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)是識別并檢測沒食子?；年P(guān)鍵。近年來,流動注射與化學(xué)發(fā)光法的結(jié)合在食品、藥物、生物分析等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[42]。選用合適的顯色劑結(jié)合化學(xué)發(fā)光法,可快速表征沒食子鞣質(zhì)和沒食子酸含量,是一種靈敏度高、線性范圍寬且成熟的分析技術(shù)。Kanwal等[43]建立了一種用于2種以上鄰苯三酚化合物檢測的流動注射與化學(xué)發(fā)光法系統(tǒng),該系統(tǒng)依賴于鄰苯三酚在磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)的弱堿性介質(zhì)中對KMnO4-H2O2體系化學(xué)發(fā)光信號的增強影響。由于該系統(tǒng)能夠?qū)ν瑫r存在的多種鄰苯三酚化合物進行檢測,因此十分適宜于測定藥材中以不同形式結(jié)合存在的沒食子?；２贿^該系統(tǒng)可能還會受到余甘子中其他具有連苯三酚結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的干擾,例如一些黃烷醇與黃酮類成分。雖然其專屬性目前來說并不占優(yōu)勢,但沒食子?；Y(jié)構(gòu)化合物在余甘子中占比極高,它仍可能是一種非常適合余甘子質(zhì)量快速評價的方法。

5.3 現(xiàn)代炮制工藝有待規(guī)范 已有研究表明,余甘子在各民族有各自的炮制方式,例如鹽制、牛奶制、蜜制、醋制等,且在炮制過程中,余甘子中的物質(zhì)基礎(chǔ)會發(fā)生顯著變化,但在《中華人民共和國藥典》以及各省市炮制規(guī)范中并未對余甘子炮制工藝參數(shù)進行相關(guān)規(guī)定,例如余甘子的炮制溫度、炮制輔料、炮制時間等,不同的炮制工藝下余甘子的物質(zhì)基礎(chǔ)差異較大,影響臨床有效性的發(fā)揮。因此,可將“傳統(tǒng)功效-炮制工藝-活性成分”進行關(guān)聯(lián)研究,在優(yōu)選余甘子功效質(zhì)量標志物的基礎(chǔ)上,確立合理、規(guī)范、可控的現(xiàn)代炮制工藝。

5.4 余甘子藥用形式多樣 2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定余甘子的基源為大戟科植物余甘子P.emblicaL.的干燥成熟果實,但余甘子在不同國家、醫(yī)藥體系和歷史時期中藥用形式多樣[1]。余甘子鮮果及果汁干粉在印度以及中國廣東、福建等地常用,而余甘子干鮮品的化成分差異明顯,但余甘子鮮干功效差異研究卻很少見[44]。此外,《英國藥典》與《印度藥典》收載的余甘子應(yīng)用形式為余甘子的去核果肉,課題組前期實驗發(fā)現(xiàn),余甘子果核多酚類成分豐度以及抗氧化活性遠小于果肉,建議將余甘子果肉與不去核果實分為2種商品規(guī)格[45]。余甘子樹皮為西雙版納傣醫(yī)習(xí)用藥材,但進行急性毒性時發(fā)現(xiàn)余甘子樹皮灌胃給藥,對小鼠有一定毒性。余甘子是世界范圍的多民族用藥,其各種藥用形式需進行更加完善的藥理藥效學(xué)研究,以確保用藥的有效性和安全性。

隨著余甘子生態(tài)環(huán)境價值、農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值以及藥用價值不斷被發(fā)現(xiàn),其逐漸展露出了農(nóng)業(yè)種植以及中藥大品種培育與開發(fā)的潛力。作為藥食同源、活性成分易轉(zhuǎn)化的中藥品種,余甘子質(zhì)量標準制定應(yīng)考慮其特殊質(zhì)量形成與傳遞規(guī)律,構(gòu)建適應(yīng)余甘子在多元化產(chǎn)品發(fā)展中需求的質(zhì)量標準。