基于頂空固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的余甘子揮發(fā)性成分分析及抗倉儲害蟲作用研究

黃浩洲 張定堃 李夢琪 譚 鵬 包曉明 莫太剛 樊三虎 韓 麗 林俊芝

(1 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)研究院,西南特色中藥資源國家重點實驗室,成都,611137; 2 四川護理職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系,成都,610100; 3 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點研究室,成都,610041; 4 島津企業(yè)管理(中國)有限公司,成都,610023; 5 成都市三勒漿藥業(yè)集團,成都,610000; 6 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院代謝性疾病中醫(yī)藥調(diào)控四川省重點實驗室,成都,610072)

余甘子PhyllanthusemblicaL.是大戟科葉下珠屬熱帶、亞熱帶落葉小喬木的果實[1],俗名滇橄欖、油甘子、山油甘、庵摩勒等,是我國西南地區(qū)重要的藥食同源中藥資源與經(jīng)濟作物[2]。余甘子功能潤肺化痰,生津止渴,在利咽、降糖、調(diào)節(jié)血脂代謝、預(yù)防牙齦炎等方面治療和保健作用突出[3]。因此,余甘子在我國藏族、蒙古族、維吾爾族、彝族等16個少數(shù)民族中廣泛應(yīng)用,并在全球17個國家的傳統(tǒng)藥物體系中廣泛使用[4],是聯(lián)合國衛(wèi)生組織指定全球推廣種植的3種保健植物之一。

余甘子氣味清香,回味甘甜。其表皮含有一定精油[5],芳香避穢,賦予其獨特風(fēng)味。故余甘子被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和飲料等行業(yè)。研究顯示,余甘子精油具有較強的抗菌及抗氧化作用[6-7],是上述功能的主要物質(zhì)載體之一[8]。課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn),與其他藥材形成鮮明比較,余甘子在長期貯藏過程中無任何病蟲害現(xiàn)象,推測可能與余甘子獨特的氣味和揮發(fā)性成分有關(guān)[8]。通過文獻分析發(fā)現(xiàn),在中國和印度,民間常用余甘子退熱、驅(qū)蟲、止瀉或殺菌抑菌作用[9],具有一定芳香避穢作用。但目前,關(guān)于其抗蟲效果及物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)研究未見報道,本文遂對其展開研究。

本研究采用超臨界CO2萃取技術(shù)對余甘子藥材揮發(fā)性成分進行萃取富集得到精油,并基于頂空-固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Headspace Solid Phase Microextraction Gas Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry，HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS),對余甘子藥材及精油成分進行分析。該技術(shù)通過建立150多種常見氣味成分的多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring,MRM)定性離子對、母離子質(zhì)荷比(m/z)、保留時間(Retention Time,RT)及內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線等關(guān)鍵定性定量數(shù)據(jù)庫,可快速準(zhǔn)確地定性定量余甘子的關(guān)鍵氣味成分[10]。此外,本文通過氣味強度分析建立了氣味強度特征譜,可快速分析余甘子揮發(fā)性成分氣味物質(zhì)及抗蟲作用物質(zhì)基礎(chǔ)。最后,本文以進食率、死亡率和趨避距離為評價指標(biāo),對余甘子藥材及精油抗倉儲害蟲的效果進行了評價。通過上述實驗,以期為余甘子揮發(fā)油物質(zhì)基礎(chǔ)、提取及應(yīng)用等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分析樣品 余甘子藥材,購于中庸飲片有限公司(四川成都),批號：200601Z。

1.1.2 供試?yán)ハx 供試?yán)ハx為北京清析研究院實驗室人工飼養(yǎng)的昆蟲。在溫度為(26±1)℃,相對濕度55%～75%的養(yǎng)蟲室中,用全麥粉∶干酵母粉=20∶1(質(zhì)量比)混合而成的飼料飼養(yǎng)藥材甲、咖啡豆象、米象、印度谷蛾供實驗使用。

1.1.3 試劑 苯乙酮，萘，2,6-二氯苯酚和2,4,6-三氯苯甲醚對照品(Sigma公司，美國，批號分別為：48292，40053，40302，47526-U，質(zhì)量濃度分別為2，5，2，2 μg/mL，)；4-溴氟苯和1,2-二氯苯-d4的混合對照品溶液、苊-d10對照品溶液(o2si公司，美國，批號分別為310239，314514，304594，質(zhì)量濃度均為100 μg/L)。

1.1.4 儀器 超臨界CO2萃取裝置(海安華達石油儀器有限公司，型號:SFE230-50-06);三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(島津公司，日本，型號：TQ8050)PAL加熱磁力攪拌模塊和PAL SPME Arrow固相微萃取進樣器(思特斯分析儀器有限公司，瑞士，序列號:ARR15-DVB/C-WR-120/20CT,CTC);電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司，型號：XPE26)。

1.2 方法

1.2.1 CO2超臨界萃取方法 采用一次加料,一級萃取,一級分離的方法萃取余甘子精油。取余甘子藥材粉末(過三號篩),500 g一次性加入萃取罐(1 L),對CO2貯罐進行冷卻,設(shè)置萃取釜1和萃取釜2的溫度為55 ℃和50 ℃,設(shè)置分離釜1和分離釜2溫度55 ℃和50 ℃,當(dāng)溫度分別達到55 ℃和50 ℃,萃取釜壓力27 MPa,當(dāng)解析罐的壓力達到6 MPa時關(guān)閉CO2鋼瓶,開始循環(huán)萃取,調(diào)節(jié)CO2流量至2.5 mL/min/,恒溫恒壓萃取3 h,從解析罐中得到余甘子精油[6]。

1.2.2 HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS氣相色譜條件 采用InertCap Pure-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱;進樣口溫度250 ℃,分流進樣,分流比為5∶1,進樣口壓力為83.5 kPa;高純氦氣作為載氣,控制方式為恒壓模式;吹掃流量3.0 mL/min;升溫程序為:初始溫度50 ℃維持5 min,并以10 ℃/min程序升溫至250 ℃保持10 min;柱平衡時間為2 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源為電子轟擊源,離子化能量70 eV,離子源溫度200 ℃,質(zhì)譜傳輸接口溫度為250 ℃,碰撞氣體為氬氣;質(zhì)譜監(jiān)測模式為MRM模式,檢測器電壓相對于調(diào)諧結(jié)果+0.3 kV,溶劑延遲時間為1.3 min。不同化合物的監(jiān)測離子對、碰撞電壓見表1。為提高檢測靈敏度,本實驗采用時間分段監(jiān)測各化合物。

表1 150個化合物定性定量參數(shù)和基本信息

1.2.4 頂空-固相微萃取條件 精密吸取余甘子精油(0.1 mL),用研缽與0.5 g淀粉共研磨,使之充分吸附于淀粉上進行稀釋,避免過飽和而影響分析準(zhǔn)確性。同時,精密稱取余甘子藥材粉末(過三號篩)0.5 g,將上述精油粉末和藥材粉末分別置于惰性頂空瓶內(nèi)(20 mL),壓蓋密封,50 ℃平衡40 min。進樣前后,固相萃取頭被置于270 ℃老化裝置中進行老化(3 min),然后插入頂空瓶內(nèi),在50 ℃恒溫下萃取吸附樣品揮發(fā)性成分10 min,抽出萃取頭并迅速插入已進入預(yù)運行狀態(tài)下的氣相色譜-質(zhì)譜進樣口,于250 ℃狀態(tài)下解吸附(2 min)后進入質(zhì)譜進行分析。

1.2.5 供試品定性定量檢測方法 精密吸取1 μL 4種化合物混標(biāo)進樣分析,評估其系統(tǒng)適用性(取10 mL容量瓶中加入各10 μL的4種標(biāo)準(zhǔn)品溶液,定容搖勻,0.22 μm微孔濾膜過濾即可)。再精密吸取1 μL 3種內(nèi)標(biāo)物(0.1 μg/mL)的混標(biāo)分析,獲得內(nèi)標(biāo)物峰面積。最后按照上述條件檢測樣品。所采集數(shù)據(jù)由島津TQ8050軟件150種化合物的定性離子對數(shù)據(jù)庫進行定性比對,比對后再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的實測峰面積進行定量。

1.2.6 抗蟲實驗設(shè)計 準(zhǔn)備3個30 cm×30 cm×30 cm的透明玻璃方格,分別標(biāo)記為A格B格C格,格內(nèi)分別放入1 g余甘子藥材和蟲體各3只,觀察其死亡率,進食率和趨避距離。在A格內(nèi)滴入乙醇1 mL,在B格內(nèi)滴入余甘子揮發(fā)油1 mL,C格內(nèi)放入余甘子藥材,每天觀察,趨避距離及進食率在3 h、5 h、7 h進行上述觀察。

1.2.7 氣味閾值計算 氣味閾值是指引起人類氣味刺激最小的物質(zhì)的濃度(pg/mg)。從閾值的定義可以看出,閾值越低,含量越高,則氣味越強。濃度與閾值的比值稱為氣味活度值(Odor Activity Value，OAV):

式中:C代表組分的含量(pg);M代表樣品質(zhì)量(mg);Th代表組分的氣味閾值(pg/mg)。一般而言,OAV大于0.1的成分應(yīng)視為對其氣味有貢獻的成分。

2.7 數(shù)據(jù)處理 使用Hiplot(https://hiplot.com.cn)箱圖工具進行分析。采用SPSS 22.0工具美國(伊利諾伊州芝加哥市SPSS公司)和Oringin 2018(美國馬薩諸塞州漢普頓市OriginLab)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 余甘子藥材及精油揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果 根據(jù)數(shù)據(jù)庫的定性定量分析,余甘子精油和藥材的MRM總離子流圖見圖1,揮發(fā)性成分的檢測結(jié)果見表2和表3。從圖1中可發(fā)現(xiàn),CO2超臨界提取富集的成分更多,含量更高。從表2和表3中可知,余甘子藥材和精油中分別篩查出70種和58種揮發(fā)性化學(xué)成分。此外,研究發(fā)現(xiàn),余甘子揮發(fā)性成分中多種成分具有特殊香味,如(E)-2-庚烯醛、癸醛、α-松油醇、5-甲基呋喃醛等含量較高的藥材和精油共有成分,它們具有一定的芳香味,可能是余甘子風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)。進一步對揮發(fā)性成分進行了定量分析發(fā)現(xiàn),藥材和精油中均以乙酸的含量最高,這是其酸味氣味的物質(zhì)基礎(chǔ)(圖2A,B中最高的峰為乙酸)。但精油中含量略低,可能與超臨界提取的物質(zhì)的極性有關(guān)。

表2 余甘子精油化學(xué)成分鑒定結(jié)果

表3 余甘子藥材化學(xué)成分鑒定結(jié)果

從表2和表3數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn),精油與藥材成分大致相似。其中含量較高的成分以乙酸、乙酸乙酯、正辛醛、(E)-2-庚烯、α-松油醇、5-甲基呋喃醛、己酸、丁酸和丙酸等為主。不難發(fā)現(xiàn),余甘子富含酸類成分,該類成分對昆蟲無殺蟲作用,但其刺激性氣味具有一定的趨避作用。此外,該類物質(zhì)對于微生物具有較強的抑制作用。

2.2 余甘子氣味成分譜與氣味強度特征譜 為了更清晰直觀地反映余甘子藥材和精油中的化學(xué)成分含量及氣味貢獻程度,本文基于其濃度和(OAV,構(gòu)建了余甘子氣味成分譜(Odor Component Spectrum,OCS)和氣味強度特征譜(Odor Intensity Characteristic Spectrum,OICS)。在圖2中,以150種氣味化合物編號為橫坐標(biāo)(化合物名稱以表1編號代替),以氣味強度為縱坐標(biāo),得到余甘子氣味強度特征譜。根據(jù)2.6中氣味閾值的計算得到氣味強度,一般認為氣味強度大于0.1的成分,表示它能被人體識別并產(chǎn)生氣味貢獻。通過樣品的氣味特征譜,可快速地發(fā)現(xiàn)對氣味變化有關(guān)鍵貢獻的化合物,并較為直觀、方便地表征其整體氣味輪廓差異,分析關(guān)鍵活性成分。

從OCS整體來看,CO2超臨界提取富集得到的成分更多,含量更高,主要以萜烯類極性較小的成分為主(76號化合物),而極性較大的成分如乙酸等的富集較藥材更少。從圖2A和B都可直觀展發(fā)現(xiàn),余甘子藥材和精油中均含有大量的乙酸。然而在氣味特征譜中,由于乙酸等成分的閾值較高,所以對氣味的貢獻并不十分明顯。而一些含量較低的成分反而具有較大的氣味貢獻,如50和78號成分等。這些微量成分可能是構(gòu)成余甘子特殊風(fēng)味的關(guān)鍵。氣味閾值是氣味成分和氣味受體蛋白結(jié)合的綜合體現(xiàn)。因此,構(gòu)建氣味強度特征譜,進一步明確昆蟲氣味閾值,對于抗蟲氣味成分的篩選具有一定意義。

2.3 余甘子藥材及精油抗蟲作用測定結(jié)果 采用死亡率、進食率和趨避作用對余甘子抗蟲作用進行研究,結(jié)果如圖3和圖4所示。死亡率結(jié)果顯示:空白組中藥材甲,咖啡豆象,米象,印度谷蛾在實驗開始后,未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,死亡出現(xiàn)在最后2 d,死亡率為17%。余甘子精油組中,第3天開始死亡率開始上升到33%左右,第4天后死亡率增加到66%,并趨于穩(wěn)定,第7天全部死亡。余甘子藥材組中隨著進食天數(shù)的增加,死亡率從第3天開始逐漸增加到17%,第4天25%,第5天58%,第6天75%,最終實驗結(jié)束后全部死亡。進食率結(jié)果顯示:空白組中藥材甲,咖啡豆象,米象,印度谷蛾的進食率在最開始出現(xiàn)一定的昆蟲不進食的現(xiàn)象,以前2個昆蟲為主,其余昆蟲影響不大。余甘子精油組中,不同昆蟲進食率有一定下降,但都在94%以上。余甘子藥材組中,進食率呈進一步下降的趨勢,但總體在96%以后3個。對以上結(jié)果顯示,余甘子精油和藥材對倉儲害蟲具有一定的毒性作用,但對進食率影響不大。

趨避距離結(jié)果顯示:空白組中昆蟲在加入乙醇后,均往玻璃格邊緣靠近。隨著實驗開始,昆蟲活動區(qū)域開始逐漸變大,噴灑區(qū)域也開始出現(xiàn)活動跡象,慢慢聚集在進食區(qū)域,昆蟲趨避距離從10～15 cm降低為5～8 cm。余甘子精油組中,藥材甲,咖啡豆象,米象,印度谷蛾開始明顯遠離進食區(qū)域,分散在邊緣處,且初始趨避距離較大,在10～15 cm以上。其中米象的趨避距離甚至隨時間推移增加,達到18 cm左右。其他昆蟲趨避距離有一定下降趨勢,但整體明顯高于空白組。余甘子藥材組中4種昆蟲在開始明顯遠離進食區(qū)域,主要分布在邊緣處以及進食區(qū)與邊緣處中間位置,趨避距離達到9～13 cm。隨著時間推移,趨避距離雖有一定下降,但是下降趨勢較精油組更弱。以上結(jié)果顯示,余甘子藥材和精油短期內(nèi)驅(qū)蟲效果明顯,以精油最佳。

3 討論

近年來,利用植物源性殺蟲劑控制倉儲害蟲的研究已引起了廣泛關(guān)注。其具有良好的生物活性,是綠色驅(qū)蟲劑的替代品之一,具有抗菌、消炎、抗氧化、驅(qū)蚊和驅(qū)蟲的作用,對環(huán)境友好、對人畜安全,易于分解,并有使節(jié)肢動物產(chǎn)生耐藥性降低的可能[11]。

研究發(fā)現(xiàn),高含量的酸類成分可能是余甘子久置不腐的原因之一[12]。乙酸乙酯對昆蟲有一定的麻醉作用,在昆蟲學(xué)實驗中,乙酸乙酯是一種常用的窒息劑,常用于昆蟲的采集[13],具有一定的驅(qū)蟲作用。此外,α-松油醇廣泛存在于植物精油中,對玉米象、小菜蛾等害蟲具有良好的趨避和殺蟲活性,致死中濃度為3.22 mg/L左右,是一種不可多得的天然產(chǎn)物[14]。而一種抗蟲的重要物質(zhì)芳樟醇在藥材中大量存在,但是在精油中含量更少[15]。推測可能和其自身理化性質(zhì)有關(guān),需要進一步優(yōu)化提取工藝。此外,余甘子精油和藥材中還含有一定的薄荷腦、香葉醇、苯酚、萘等成分,是一類具有一定抗蟲驅(qū)蟲及抗菌作用的物質(zhì)[11],但含量相對較低,可能起到輔助作用。綜合來看,其抗蟲作用更是“多組分、多效應(yīng)、多層次”的綜合結(jié)果,上述成分可能是余甘子“芳香避穢”的物質(zhì)基礎(chǔ)[16-17]。

此外,由于提取極性的原因,超臨界提取大部分是極性較弱的成分,而部分抗蟲成分如乙酸乙酯、芳樟醇及一些抗微生物的成分如乙酸、丙酸、丁酸等含量較少,但α-松油醇等萜烯類及單萜類含量較高。這導(dǎo)致藥材和精油的抗蟲作用各有自身特點。藥材中小分子酸類成分等抗蟲抑菌成分含量較高,而精油中脂溶性萜類成分明顯含量更高。抗蟲成分主要以萜烯類成分為主,總體而言精油的抗蟲效果更佳。綜合抗蟲作用研究表明,余甘子的抗蟲作用較強,但表現(xiàn)為驅(qū)蟲作用而非殺蟲作用。但其抗蟲作用可能并非單一成分的作用,而是“多組分、多效應(yīng)、多層次”的協(xié)同作用結(jié)果[18]。后期可進一步通過氣味結(jié)合蛋白、氣味受體的觸角生物電位作用篩選抗蟲關(guān)鍵成分[19-20],探明抗蟲機制,進一步優(yōu)化其提取制備工藝。本文首次提出余甘子抗倉儲害蟲作用,對其物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究,并初步評價了其抗蟲活性,以期為余甘子抗蟲作用挖掘和應(yīng)用開發(fā)提供參考。