微生物強化對西式發(fā)酵薩拉米香腸理化指標與揮發(fā)性風味成分的影響

張亞琳，陳福生

(華中農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430000)

發(fā)酵香腸也稱生香腸，是指將一定比例和大小的豬肉或牛肉等的瘦肉丁及其脂肪顆粒，與適量的蔗糖、食鹽、香辛料等輔料充分混合均勻后，灌進腸衣，經(jīng)自然或強化微生物發(fā)酵后，制成的具有穩(wěn)定微生物學特性與典型發(fā)酵香味的肉制品[1]。在漫長的發(fā)展過程中，世界各地都誕生了具有本地特色的發(fā)酵香腸，大體上可分為中式和西式發(fā)酵香腸兩大類[2]。其中，中式發(fā)酵香腸一般在食用前需要蒸煮熟化，而西式的香腸，通常無需蒸煮就可直接食用[3]。意大利的薩拉米香腸是西式發(fā)酵香腸中的典型代表之一，因獨特的口感，在歐洲等地擁有很好的知名度，深受消費者歡迎[4]。隨著我國開放程度的日益增加和消費水平的不斷提高，薩拉米發(fā)酵香腸等西式發(fā)酵肉制品正迅速搶占我國發(fā)酵肉制品的高端市場，給我國發(fā)酵肉制品產(chǎn)業(yè)帶來很大的壓力。

薩拉米發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過程一般可分為高溫發(fā)酵(22～24 ℃)和低溫成熟(10～14 ℃)2個階段，高溫發(fā)酵時間通常為7 d，而低溫成熟時間大約為30～40 d[5]。根據(jù)發(fā)酵過程中是否強化微生物，薩拉米香腸可分為不強化微生物的自然發(fā)酵產(chǎn)品，以及強化微生物的強化發(fā)酵產(chǎn)品。通常前者的風味特色鮮明，但存在發(fā)酵時間長，批次間差異性較大，若發(fā)酵條件控制不當，還有可能被有害微生物污染等問題[6]；而后者通過針對性地強化一些有益微生物，不僅可縮短發(fā)酵周期，改良香腸的風味，同時還可很好地控制有害微生物生長，降低亞硝酸鹽等有害成分的含量，保證香腸的品質(zhì)，并保持不同批次產(chǎn)品的一致性[7]。

李超等[8]通過將乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)混合發(fā)酵制得營養(yǎng)豐富、口味獨特、風味良好的鴨肉香腸。李靜雯等[9]在山羊肉中添加乳酸片球菌和米根霉(Rhizopusoryzae)混合發(fā)酵得到酸度適宜、感官評分高、羊膻味低、風味優(yōu)良的羊肉香腸。PEDONESE等[10]將清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)接種到香腸中，發(fā)現(xiàn)它們可抑制單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和革蘭氏陰性腐敗微生物等食源性病原菌的生長。

婁地青霉(Penicillumroqueforti)因其對蛋白質(zhì)和脂肪的分解能力，一直被廣泛用作藍紋奶酪的發(fā)酵劑[11-12]。GUO等[13]將婁地青霉接種至雞胸肉中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵成熟后的雞胸肉由條狀變?yōu)轭w粒狀，硬度和彈性降低，黏性和持水能力提高，風味化合物尤其是醛類物質(zhì)的種類和含量都有明顯增加。但將乳酸片球菌和婁地青霉混合強化發(fā)酵香腸還未見相關研究報道。本研究擬分別或同時強化乳酸片球菌和婁地青霉，以探究它們對薩拉米香腸發(fā)酵過程中理化指標和揮發(fā)性風味物質(zhì)及感官的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗原料、菌種與培養(yǎng)基

豬肉、天然豬腸衣、食鹽、糖、黑胡椒、大蒜粉、肉豆蔻等原輔料，市售。

乳酸片球菌、婁地青霉分別分離自美國Columbus Secchi的薩拉米香腸和意大利的藍紋奶酪。

PDA、MRS培養(yǎng)基，武漢市中南化學試劑三廠;環(huán)己酮，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。其他化學試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

PTDQ型絞肉機，丹徒區(qū)辛豐金匯緣食品機械廠；THMGF350A型灌腸機，佛山市順德區(qū)騰輝電氣有限公司；TQ8040型氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司；SX811-BS型穿刺式pH計，上海三信儀表廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 薩拉米香腸的制作

1.3.1.1 強化微生物的制備

將乳酸片球菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，轉接3次后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，菌體以無菌生理鹽水洗滌3次后重懸得到菌懸液，備用。

將婁地青霉接種至PDA斜面上，25 ℃培養(yǎng)4 d后，以無菌水洗脫孢子，經(jīng)3層無菌紗布過濾后，打散孢子，調(diào)整孢子濃度至105個/mL，備用。

1.3.1.2 工藝流程

原料肉預處理→預斬→絞制→撒料→接種乳酸片球菌→攪拌→灌裝→表面接種婁地青霉→高溫發(fā)酵→低溫成熟→成品

1.3.1.3 操作要點及微生物強化

(1)豬肉處理：將豬肉洗凈并剔除筋膜和淤血后，將肥肉和瘦肉切成長×寬×厚為10 cm×3 cm×3 cm的條塊，肥肉經(jīng)2 mm孔板切丁，瘦肉以3 mm孔板絞制，按肥瘦比3∶7(g∶g)混勻，得到豬肉預混物。

(2)輔料添加：將輔料按食鹽3%、糖0.5%、黑胡椒0.02%、蒜粉0.3%和肉豆蔻0.02%(占豬肉預混物比例)[14]加入豬肉預混物中，混合均勻。

(3)乳酸片球菌強化：將乳酸片球菌菌懸液接種至(2)的物料中，調(diào)整乳酸片球菌的濃度至107CFU/g物料，混勻，得肉餡。

(4)灌腸：將肉餡灌入腸衣(Φ=3 cm)內(nèi)，1 cm3腸衣內(nèi)灌肉餡1.5 g，每隔15～20 cm用棉繩結扎，分節(jié)。

(5)婁地青霉強化：將(4)中制備的新鮮香腸浸泡于婁地青霉孢子液中5 min，然后瀝干至香腸表面無游離水。

(6)發(fā)酵：將新鮮香腸置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵。在相對濕度80%，溫度20～22 ℃發(fā)酵7 d后，再在相對濕度70%，溫度12 ℃繼續(xù)發(fā)酵31 d，總共發(fā)酵時間為38 d。

香腸發(fā)酵分為自然發(fā)酵組(CK)，以及分別強化乳酸片球菌(PL)、婁地青霉(PR)及其復合物(PLR)，共4組薩拉米香腸。

CK：由(1)、(2)、(4)和(6)制得，并加入與(3)中菌懸液同等體積的無菌水；PL：由(1)、(2)、(3)、(4)和(6)制得；PR：由(1)、(2)、(4)、(5)和(6)制得，并加入與(3)中菌懸液同等體積的無菌水；PLR：按(1)～(6)制得。

1.3.2 薩拉米香腸主要理化指標的分析

對香腸整個發(fā)酵過程中的第0、2、4、6、8、13、18、23、28、33、38 天的pH值、水分含量、亞硝酸鹽含量、酸價進行測定。

1.3.2.1 pH值測定

使用校準后的肉類專用穿刺式pH計插入香腸的兩端及中間3個部位，控制pH計插入深度為4～5 cm，使pH計的電極探頭充分接觸到香腸，待pH計穩(wěn)定后讀數(shù)，取3次結果的平均值。

1.3.2.2 水分含量測定

取適量香腸樣品置烘干箱中，105 ℃干燥至質(zhì)量恒定，按公式(1)計算水分含量:

(1)

式中：m1，干燥前樣品與稱量瓶質(zhì)量，g；m2，干燥后樣品與稱量瓶質(zhì)量，g；m3，稱量瓶質(zhì)量，g。

1.3.2.3 亞硝酸鹽含量和酸價測定

亞硝酸鹽含量測定參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法；酸價測定參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》中的冷溶劑指示劑滴定法。

1.3.3 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

參照王德寶[15]的方法并稍作修改。稱取剪碎后的香腸樣品2～3 g，置于15 mL頂空瓶中，將老化好的萃取針插入樣品瓶并于60 ℃恒溫水浴鍋中加熱平衡30 min后，推出纖維頭，使纖維頭暴露于樣品上部空間，頂空吸附30 min后拔出，萃取頭在GC-MS進樣口(250 ℃)下解吸附5 min。

GC條件：DB-5石英毛細柱(30 m×320 μm，0.25 μm)，載氣He，流速1 mL/min，進樣時間1 min；升溫程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫到150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升溫到200 ℃，最后以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

MS條件：離子源溫度250 ℃，進樣口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z30-400。

定性定量分析：以Wiley、Nistdemo質(zhì)譜庫進行定性分析，匹配度≥800為鑒定依據(jù)，結合解析譜圖，確定風味物質(zhì)。采用內(nèi)標法進行定量，內(nèi)標物為環(huán)己酮。按公式(2)計算：

揮發(fā)性風味物質(zhì)含量/[μg·(100 g)-1]=

(2)

1.3.4 感官評價

參照SIDIRA等[16]的感官評價方法并稍作修改。將發(fā)酵38 d成熟的薩拉米香腸切成3 mm左右的薄片，觀察香腸切片的外觀、組織狀態(tài)，品嘗香腸的滋味與風味和口感，并進行總體可接受程度評價。評價小組由15名食品專業(yè)的學生組成且進行感官評價前未食用刺激性食物。具體評價標準如表1所示。

表1 薩拉米香腸感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of salami

續(xù)表1

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3次，結果表示為平均值±標準差。所有數(shù)據(jù)均采用 Excel 2010和 SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理和顯著性分析(P<0.05)；采用 Origin 2018 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 薩拉米香腸發(fā)酵過程中主要理化指標的變化

2.1.1 pH隨發(fā)酵時間的變化

pH值對薩拉米香腸的發(fā)酵與品質(zhì)都非常重要，較低的pH值可抑制有害微生物，特別是食源性病原微生物的生長，而且pH值也可影響肉中蛋白質(zhì)的變性、調(diào)節(jié)酶的活性，影響產(chǎn)品的黏度、硬度、感官等。由圖1可知，在高溫發(fā)酵階段(前7 d)，隨著發(fā)酵時間的延長，薩拉米香腸的pH值均呈現(xiàn)迅速下降趨勢。pH值的下降速度PL≥PLR>PR>CK，發(fā)酵至第6天時，它們的pH值分別為：(4.75±0.01)、(4.80±0.03)、(4.92±0.03)、(5.23±0.01)；而在低溫成熟階段(7～38 d)，pH值均緩慢上升，發(fā)酵結束時(38 d)，pH值分別為：(5.20±0.01)、(5.32±0.03)、(5.39±0.02)、(5.39±0.03)。在高溫干燥階段，微生物尤其是乳酸菌迅速繁殖產(chǎn)生乳酸等有機酸使香腸pH 快速下降，強化微生物的香腸因可產(chǎn)生更多有機酸而使pH值下降速度更快[17]。在強化PR和PLR的香腸中，pH值的下降(高溫發(fā)酵階段)和上升(低溫成熟階段)均較強化PL的慢，可能是因為PR在產(chǎn)生有機酸的同時也可分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生對pH具有緩沖能力的氨基酸[18]。

在整個發(fā)酵階段，強化微生物薩拉米香腸的pH值始終低于CK，較低的pH可以抑制有害微生物的生長，更好地保證薩拉米香腸的品質(zhì)。

圖1 薩拉米香腸發(fā)酵過程中pH值變化Fig.1 Changes in pH values of salami sausage during fermentation

2.1.2 水分含量隨發(fā)酵時間的變化

香腸中水分的含量對其安全性與貯藏均有重要影響。由圖2可知，在整個發(fā)酵過程中，4組薩拉米香腸的水分含量均呈現(xiàn)下降，在第0～18天，強化微生物的薩拉米香腸的水分含量均略高于CK，這與李權威[19]的研究結果一致?？赡芤驗閺娀⑸锖?，產(chǎn)生更多水溶性物質(zhì)，從而將水分“鎖住”，但在第23～38天，4組薩拉米香腸水分含量逐漸穩(wěn)定并趨于一致，發(fā)酵結束時(38 d)水分含量均約為9%，符合世貿(mào)組織對薩拉米香腸產(chǎn)品水分含量的要求[G/TBT/N/KEN/1018 Fermented sausages (salami)—Specification]。

圖2 薩拉米香腸發(fā)酵過程中水分含量變化Fig.2 Changes in water contents of salami sausage during fermentation

2.1.3 亞硝酸鹽含量隨發(fā)酵時間的變化

發(fā)酵過程中肉類物料中的硝酸鹽可還原為亞硝酸鹽，可改善香腸的色澤，提高香腸的感官品質(zhì)，但過量的亞硝酸鹽會給人體健康帶來危害。由圖3可知，在發(fā)酵過程中，亞硝酸鹽含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中發(fā)酵的前2 d，亞硝酸鹽的含量快速上升，隨后緩慢上升或下降。CK的亞硝酸鹽含量在0～6 d逐漸上升，之后緩慢下降，而微生物強化組從第2天后亞硝酸鹽含量均開始下降，發(fā)酵結束時其亞硝酸鹽含量遠低于CK(P<0.05)?？赡苁窃谳^低pH條件下(圖1)，亞硝酸鹽更容易進一步轉化為亞硝基，并與香腸中的其他物質(zhì)結合，或PL和PR產(chǎn)生的相關酶使亞硝酸鹽轉化為N2，從而使產(chǎn)品中的最終亞硝酸鹽含量降低[20]。盡管發(fā)酵結束時CK中亞硝酸鹽含量(8.74 mg/kg)遠大于強化組，但各組亞硝酸鹽含量都低于國家標準30 mg/kg(GB 2760—2014 《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》)。

圖3 薩拉米香腸發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化Fig.3 Changes in nitrite content of salami sausage during fermentation

2.1.4 酸價隨發(fā)酵時間的變化

酸價顯示了香腸中游離脂肪酸的含量，其高低是衡量脂肪氧化程度的重要指標之一，脂肪過度氧化產(chǎn)生的“哈”味會影響香腸等肉類發(fā)酵產(chǎn)品的可接受度。由圖4可知，薩拉米香腸的酸價在整過發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，但強化微生物組的酸價始終低于CK組，且成熟時的酸價顯著低于CK(P<0.05)。這一方面可能是PL和PR產(chǎn)生的過氧化氫酶，阻礙了O2向香腸內(nèi)部的滲透，從而減緩了脂肪氧化；另一方面，也可能是PL和PR產(chǎn)生的水溶性物質(zhì)包裹了脂肪粒，更好地阻止了O2與脂肪接觸，從而減緩了香腸中脂肪的氧化[21]。

圖4 薩拉米香腸發(fā)酵過程中酸價變化Fig.4 Changes in acid values of salami sausage during fermentation

2.2 揮發(fā)性風味成分比較分析

揮發(fā)性風味化合物對發(fā)酵香腸的發(fā)酵香味有著重要貢獻。采用頂空固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析了發(fā)酵結束時薩拉米香腸中揮發(fā)性成分，相應分析結果見電子版增強出版附件(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031260)。

附件表中的結果顯示，強化微生物后對薩拉米香腸的揮發(fā)性風味成分有明顯影響。相比于CK，強化微生物后，薩拉米香腸中的醛類、酸類、醇類、酯類與烴類揮發(fā)性風味成分的種類和含量均有所增加。尤其是己醛、庚醛、D-檸檬烯、3-蒈烯等對風味產(chǎn)生積極作用的物質(zhì)含量增加；但2, 6-二叔丁基對甲酚、4, 6-二甲基-十二烷、3, 7-二甲基癸烷、十七烷等產(chǎn)生刺激性不愉快氣味或?qū)︼L味貢獻較小的成分[22]，在微生物強化的薩拉米香腸中的含量減少甚至消失。

進一步對附件表中的數(shù)據(jù)分析可知，烴類化合物是薩拉米香腸的主要揮發(fā)性風味物質(zhì)，在強化微生物的薩拉米香腸中，庚烷、2, 4-二甲基-庚烷、十四烷、鄰異丙基甲苯、水芹烯、3-蒈烯、D-檸檬烯、石竹烯等烴類化合物的含量顯著高于CK(P<0.05)；而在酮類風味成分中，具有非常低的感官閾值，也是干腌肉制品中的典型風味的乙偶姻的含量也顯著高于CK(P<0.05)。強化微生物后，還產(chǎn)生了CK中沒有的乙酸異戊酯、己酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、己酸乙烯酯等酯類成分，它們可掩蓋發(fā)酵香腸中的腐臭味，與香腸的發(fā)酵風味緊密相關[23]。另外，強化微生物后，2, 3-丁二醇、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇等發(fā)酵香腸中常見的醇類物質(zhì)的含量均有所上升；己醛，作為肉制品中的典型香氣，被認為是發(fā)酵腌制產(chǎn)品中必不可少是一種脂肪醛[24]，強化PL、PR、PLR后，其含量也有明顯上升(P<0.05)。此外，微生物強化發(fā)酵后，薩拉米香腸中還含有較高的3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、L-乳酸、辛酸等具有特殊風味的酸類物質(zhì)?？傊?，強化PL、PR或PLR后，薩拉米的揮發(fā)性風味成分得到了極大的改良和提高。

2.3 成熟薩拉米香腸的感官評價

感官評價是根據(jù)香腸的外觀色澤、質(zhì)構及風味和滋味等特征直觀地對香腸進行評價，從而判斷其品質(zhì)的一項重要指標。發(fā)酵結束時，薩拉米香腸的感官雷達圖如圖5所示，4組香腸在外觀和組織狀態(tài)方面無顯著差異(P>0.05)，相較于CK，強化微生物后薩拉米香腸的滋味與風味、口感和總體可接受度提升較為明顯，這與前述風味成分的分析結果相吻合?？赡艿脑蚴菑娀奈⑸锎龠M了薩拉米香腸發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)、脂肪等的分解，增加了香腸中揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量，從而使香腸具有更加明顯的特征與口感。

圖5 薩拉米香腸感官分析Fig.5 Sensory analysis of salami sausage

3 結論

本研究的實驗結果表明，分別或同時強化PL和PR制得的薩拉米香腸，在感官與風味等方面均優(yōu)于自然發(fā)酵薩拉米香腸(CK)，且同時強化PL和PR的效果最佳。強化微生物后，香腸的亞硝酸鹽含量、酸價均顯著低于CK組(P<0.05)，產(chǎn)生的乙酸異戊酯、己酸異戊酯、乙酸己酯等風味物質(zhì)更多，香腸發(fā)酵香味更好，香腸的安全性和可食用性得到了提高。研究結果對我國發(fā)酵香腸等肉制品的研發(fā)提供了參考。