鮐魚蛋白肽的制備及其特性

馬佳雯，何璐瑤，蔡金秀，徐劉貝，曹少謙，戚向陽

(浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波，315100)

生物蛋白肽是一類由2～20個氨基酸經(jīng)過脫水縮合，相對分子質(zhì)量低于6 kDa的蛋白水解中間產(chǎn)物[1]，具有增強(qiáng)人體免疫力[2]、抗氧化[3-4]、降血壓[5]和抑菌[6]等生物功能。生物肽來源廣泛，大體可以分為植物肽和動物肽，動物肽由天然肌肽、海洋生物肽、乳品肽等組成，海洋生物較其他生物更為復(fù)雜和特殊，這使得其蛋白肽易產(chǎn)生不同于其他生物蛋白肽的功效[7]。海洋生物中魚類的數(shù)量占相當(dāng)大的比例，魚類資源豐富易捕撈，是制備蛋白肽常見的原料，目前海洋生物蛋白肽的制備多來源于低值魚及其下腳料[8]。

鮐魚(Pneumatophorusjaponicus)系鯖科鮐屬，形體較粗壯，在我國主要分布于東海和黃海海域。鮐魚具有生長迅速、年產(chǎn)量穩(wěn)定、魚汛期集中、捕撈難度較小的特點(diǎn)[9]，為我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一。目前，鮐魚主要被加工成魚干[10]、魚露[11]、魚粉[12]等低值產(chǎn)品，在深加工利用方面未得到很好的開發(fā)。鮐魚營養(yǎng)較為豐富，主要營養(yǎng)成分為蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪酸，是新型功能食品的優(yōu)質(zhì)蛋白原料[13]，具有較大的開發(fā)潛力。本文以鮐魚為原料，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化鮐魚酶解工藝，并對酶解物的相對分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、抗氧化能力及穩(wěn)定性進(jìn)行探討，旨在為鮐魚的精深加工和高效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鮐魚，寧波路林水產(chǎn)市場，清洗后去頭去骨去皮去內(nèi)臟，取魚肉攪碎備用。

K2SO4、H2SO4、硼酸、NaOH、乙醇、鹽酸、Na2HPO4、檸檬酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀等，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性、酸性、堿性、木瓜、復(fù)合、胃、胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl, DPPH)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

721G分光光度計，上海菁華公司；5804R高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；FE20實(shí)驗(yàn)pH計，上海梅特勒托利多公司；ALPHA2-4冷凍干燥儀，德國Christ公司；KDN-04C消化爐、KDN-812凱氏定氮儀，上海纖檢公司；L-8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

選用表1所示5種蛋白酶作為酶解用酶，按表1固定酶添加量(5 000 U/g)、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%)和時間(6 h)，在各酶最適溫度和pH條件下進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后于100 ℃滅酶15 min，冷卻，于4 ℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清液，以DPPH自由基清除率為主、水解度為輔評價各蛋白酶酶解效果。

表1 蛋白酶最適pH和溫度Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions of proteases

1.3.2 DPPH自由基清除率測定

參考陳思遠(yuǎn)等[14]的方法，將樣品與DPPH乙醇溶液(1×10-4mmol/mL)等體積混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm測定吸光值，記作Ay；以乙醇代替DPPH乙醇溶液，測得吸光值A(chǔ)0；以水代替樣品，測得吸光值A(chǔ)x，按公式(1)計算：

(1)

1.3.3 氨基氮含量測定

采用GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中酸度計法測定，取樣品與水混勻，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH為8.2，加入10 mL甲醛，再滴定至9.2，消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V1；用20 mL水代替樣品，操作同上，消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V2。按公式(2)計算：

(2)

式中：X,試樣中氨基態(tài)氮的含量，g/100 g；c,NaOH濃度，mol/L；0.014,1 mmol氮的質(zhì)量，g；V,取樣體積，mL；V3,取樣品稀釋液體積，mL；V4,樣品稀釋液定容體積，mL。

1.3.4 總氮含量測定

采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》的凱氏定氮法測定。

1.3.5 水解度測定

參考李美娜等[15]的方法，以樣液氨基氮與原料中總氮的比值表示，按公式(3)計算：

(3)

1.3.6 單因素試驗(yàn)

分別探究酶添加量(按物料質(zhì)量加入0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1.0%)、時間(3、4、5、6、7、10 h)、溫度(30、40、45、50、55、60 ℃)和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%、5%、10%、15%、20%、30%)對鮐魚酶解效果的影響。選取各因素最佳水平，進(jìn)行4因素3水平旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)。

1.3.7 旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定酶添加量(A)、時間(B)、溫度(C)和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(D)自變量水平，DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken模型進(jìn)行旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)，得出最佳酶解工藝條件，各因素水平見表2。

表2 BOX-Behnken因素水平設(shè)計Table 2 Factor level of BOX-Behnken test

1.3.8 抗氧化活性測定

1.3.8.1 ·OH清除率測定

參考王雪芹[16]的方法稍作修改，依次加入0.5 mL樣品、0.5 mL水楊酸乙醇溶液(10 mmol/L)和3.5 mL水混勻，再加入0.5 mL FeSO4溶液(10 mmol/L)振蕩混勻，最后加入5.0 mL新鮮配制H2O2溶液(100 mmol/L)啟動反應(yīng)，于37 ℃保溫60 min，測定波長510 nm處吸光值A(chǔ)y；以0.5 mL水代替FeSO4溶液，測得吸光值A(chǔ)0；以0.5 mL水代替0.5 mL樣品，測得吸光值A(chǔ)x，按公式(4)計算：

(4)

1.3.8.2 ABTS陽離子自由基清除率測定

參考曹葉霞等[17]的方法，將樣品與ABTS工作液按比例混勻，室溫遮光靜置60 min，于波長734 nm處測得吸光值A(chǔ)y；以PBS代替樣品，測得吸光值A(chǔ)x；以水代替ABTS工作液測得吸光值A(chǔ)0，按公式(5)計算：

(5)

1.3.9 相對分子質(zhì)量分析

參考李寧等[18]方法，將質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品過膜上樣測定相對分子質(zhì)量分布。分析條件：色譜柱TSKgel 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm)，流動相V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1，檢測波長為220 nm，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃。

1.3.10 氨基酸組成分析

參考王樂等[19]的方法，稱取適量樣品加入10 mL 6 mol/L鹽酸，氮吹封口，110 ℃靜置水解24 h，定容過濾，10 000 r/min離心，取0.2 mL上清液氮吹，加入0.02 mol/L鹽酸2 mL溶解，0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)樣測定樣品各氨基酸含量。測定條件：磺酸型陽離子分析柱(4.6 mm×60 mm，3 μm)，柱溫57 ℃，梯度洗脫，雙通道波長為440和570 nm，反應(yīng)器溫度135 ℃，茚三酮流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，每個樣品平行進(jìn)樣3次。

1.3.11 鮐魚蛋白肽抗氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.3.11.1 溫度對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

將質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品溶液置于不同溫度(4、20、40、60、80、100 ℃)下靜置2 h，然后測定其DPPH自由基清除率，按公式(6)計算抗氧化活性保持率：

(6)

1.3.11.2 pH對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品溶液，用1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)整pH(2、4、6、7、8、10、12)，室溫靜置1、2、3、4、5 h后，將樣品溶液的pH調(diào)至7，測定其DPPH自由基清除率，并計算抗氧化活性保持率。

1.3.11.3 食用糖對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

1.3.11.4 食品防腐劑對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

將樣品溶于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)的檸檬酸、山梨酸鉀、苯甲酸鈉中，終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，以蒸餾水為對照，室溫下靜置2 h，測定其DPPH自由基清除率，并計算抗氧化活性保持率。

1.3.11.5 金屬離子對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

將樣品溶液與K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+母液混合，使得樣品溶液終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，各金屬離子終濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mmol/mL，以蒸餾水為對照，室溫靜置2 h，測定其DPPH自由基清除率，并計算抗氧化活性保持率。

1.3.11.6 NaCl對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

將樣品溶于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%、4%、6%、8%和10%)的NaCl溶液中，終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，以水為對照，室溫靜置2 h，測定其DPPH自由基清除率，并計算抗氧化活性保持率。

1.3.11.7 胃腸模擬消化對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

參考劉珊珊等[20]的方法稍作修改，用人工胃液配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品溶液，于37 ℃保溫10 min，添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胃蛋白酶混勻后，分別消化1、2、3、4、5和6 h，100 ℃滅酶；將消化6 h的溶液加入等體積人工腸液，37 ℃保溫10 min，添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶混勻，分別消化1、2、3和4 h，100 ℃滅酶，快速冷卻至室溫，10 000 r/min離心15 min，取上清液測定其DPPH自由基清除率，并計算抗氧化活性保持率。

基于對國際教師教育領(lǐng)域發(fā)展趨勢與我國教師教育實(shí)踐現(xiàn)狀的把握，該項(xiàng)目以教師的反思性實(shí)踐為切入點(diǎn)?；顒拥脑O(shè)計與實(shí)施遵循“實(shí)踐—理論—實(shí)踐—理論”的循環(huán)路徑，開展敘事探究、反思性論文寫作、教學(xué)設(shè)計與實(shí)踐等。本期專題遴選了部分文章，與大家分享。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21和Design expert 10.0.7進(jìn)行分析，GraphPad Prism 7.04作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適酶篩選分析

由表3可知，固定其他條件，酸性蛋白酶的產(chǎn)物清除DPPH自由基的效果最好、水解度最高，中性酶次之。

表3 各蛋白酶對DPPH自由基清除率及水解度的影響Table 3 Effect of proteases on the degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

2.2 單因素試驗(yàn)分析

由圖1-a、1-d可知，在其他條件相同情況下，隨著酶添加量或底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，水解度逐漸增加，但其DPPH自由基清除率呈先上升后下降的趨勢，以0.2%添加量和10%底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最佳；由圖1-b、1-c可知，隨著水解時間的延長或溫度的上升，產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和水解度均先上升后下降，這可能是由于水解時間過長、溫度過高，具有抗氧化活性的多肽進(jìn)一步降解成小分子氨基酸，使其清除DPPH自由基的效果下降，水解5 h、溫度45 ℃為最佳。

a-酶添加量；b-酶解時間；c-酶解溫度；d-底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)圖1 酶添加量、酶解時間、酶解溫度和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對DPPH自由基清除率和水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on, time, temperature and substrate concentration on DPPH radical scavenging rate and degree of hydrolysis注：不同字母代表差異顯著，(P<0.05),(下同)

2.3 旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)優(yōu)化分析

2.3.1 正交結(jié)果及方差分析

鮐魚蛋白肽的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4，通過Design Expert 10.0.7對表4進(jìn)行分析，得到回歸方程：

DPPH自由基清除率/%=-4.16A2-7.47B2-4.01C2-5.30D2+2.63AB-4.30AC-1.46AD+1.06BC-2.88BD-0.65CD+2.50A+2.21B+2.89C+1.94D+60.23

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 4 Box-Behnken experiment design and results

回歸方程的方差分析見表5。

表5 回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

2.3.2 響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

由圖2可知，響應(yīng)值隨著酶添加量、時間、溫度和底物濃度的增大均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，酶添加量與溫度的交互作用最強(qiáng)，溫度和底物濃度的交互作用最弱。

a-酶添加量和時間；b-酶添加量和溫度；c-酶添加量和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；d-時間和溫度；e-時間和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；f-溫度和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)圖2 各因素交互作用對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Response surface of enzymolysis conditions on DPPH radical scavenging rate

2.3.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken模型得到鮐魚蛋白肽酶解工藝的最佳參數(shù)為：酶添加量0.211 6%(按物料質(zhì)量)、時間5.14 h、溫度53.09 ℃和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.65%。在此條件下，酶解物對DPPH自由基清除率為61.14%。為了實(shí)際操作方便，本實(shí)驗(yàn)對鮐魚蛋白肽最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行微調(diào)，即酶添加量0.21%、酶解時間5 h、酶解溫度53 ℃和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.65%。經(jīng)3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到DPPH自由基清除率為(62.23±0.15)%，與理論值相符，表明該模型對鮐魚蛋白肽最優(yōu)參數(shù)的預(yù)測有較高的準(zhǔn)確度，具有一定的實(shí)用價值，該條件酶解得率為93.25%。

2.4 相對分子質(zhì)量分布分析

由圖3可知，所制備的鮐魚蛋白肽相對分子質(zhì)量主要分布在3 kDa以下，其中相對分子質(zhì)量在1 kDa以下的組分高達(dá)92.15%。有關(guān)文獻(xiàn)研究表明，蛋白酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布在1 kDa以下的組分具有更高的抗氧化活性[21]。

圖3 鮐魚蛋白肽相對分子質(zhì)量分布圖Fig.3 Molecular weight distribution of mackerel protein peptide

2.5 氨基酸組成分析

由表6可知，鮐魚蛋白肽中人體必需氨基酸占氨基酸總量的40.10%；具有給質(zhì)子能力的氨基酸占氨基酸總量的40.06%；疏水性氨基酸占氨基酸總量的35.33%。而具有給質(zhì)子能力的氨基酸和疏水性氨基酸是影響抗氧化能力的重要因素[22]，推斷鮐魚蛋白肽具有較高抗氧化能力。

表6 氨基酸組成Table 6 The amino acid composition

2.6 抗氧化活性分析

由圖4可知，各自由基清除率與蛋白肽溶液濃度有一定的線性量效關(guān)系，清除·OH、ABTS陽離子自由基、DPPH自由基的能力隨著蛋白肽濃度增加而提高，其清除·OH、ABTS陽離子自由基和DPPH自由基的IC50為3.77、14.14、8.91 mg/mL，表明鮐魚蛋白肽具有較好的清除自由基的能力。

a-·OH；b-ABTS陽離子自由基；c-DPPH自由基圖4 蛋白肽的·OH、ABTS陽離子自由基、DPPH自由基清除能力Fig.4 ·OH, ABTS cationic radical and DPPH radical scavenging rate of protein peptide

2.7 鮐魚蛋白肽穩(wěn)定性的分析

2.7.1 溫度對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖5可知，在20～100 ℃隨著溫度升高，抗氧化活性保持率下降；但100 ℃下保溫2 h后，抗氧化活性保持率仍有80.18%。完整的二級結(jié)構(gòu)對維持肽類的生物活性十分重要[23]，處理溫度過高、加熱時間過長可能會改變鮐魚蛋白肽的二級結(jié)構(gòu)，從而影響其穩(wěn)定性。

圖5 溫度對蛋白肽穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on stability of protein peptide注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.7.2 pH對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖6可知，在pH 2.0～7.0，pH值變化對鮐魚蛋白肽的抗氧化活性保持率影響不顯著(P>0.05)；當(dāng)pH>7.0時，隨著pH升高，其抗氧化活性保持率顯著下降(P<0.05)，堿性條件可能會使肽類物質(zhì)發(fā)生外消旋或脫酰胺反應(yīng)，從而影響活性及穩(wěn)定性[24]。放置時間對其活性影響不顯著(P>0.05)。

圖6 pH對蛋白肽穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on stability of protein peptide

2.7.3 食用糖及食品防腐劑對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖7可知，在實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，不同食用糖(葡萄糖、蔗糖和果糖)及食品防腐劑對樣品的抗氧化活性影響不顯著(P>0.05)。

a-食用糖;b-食品防腐劑圖7 食用糖和食品防腐劑對蛋白肽活性的影響Fig.7 Effect of edible sugar and food preservatives on stability of protein peptide

2.7.4 金屬離子對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖8可知，不同的金屬離子對鮐魚蛋白肽活性的影響不一，隨著Zn2+和Fe3+濃度的升高，樣品的抗氧化活性顯著性下降(P<0.05)，Mg2+、K+、Ca2+對樣品的抗氧化活性影響不顯著(P>0.05)，對其抗氧化活性影響從大到小依次為：Zn2+>Fe3+>Mg2+>K+>Ca2+。當(dāng)Zn2+濃度達(dá)到5.0 mmol/mL時，其抗氧化活性保持率僅為72.5%。因此，在存儲、運(yùn)輸、生產(chǎn)及加工過程中應(yīng)盡量避免使用鋅和鐵制品。

圖8 金屬離子對蛋白肽穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of metal ions on stability of protein peptide

2.7.5 NaCl對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖9可知，隨著NaCl濃度的升高，其抗氧化活性保持率顯著性下降(P<0.05)，這可能是由于NaCl溶液濃度過高會破壞肽的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其抗氧化活性的下降。

圖9 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對蛋白肽穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of NaCl concentration on stability of protein peptide

2.7.6 胃腸模擬消化對鮐魚蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖10可知，鮐魚蛋白肽在胃液中的抗氧化活性保持率較高，達(dá)93.47%，表明較低pH及胃蛋白酶對其抗氧化活性影響不大；而在腸液中，其抗氧化活性隨著消化時間的增加呈顯著下降趨勢(P<0.05)，胃液消化6 h后，腸液再消化4 h，其終抗氧化活性保持率為30.93%。這可能是由于緩慢加熱和蛋白酶使肽鏈展開，從而使多肽進(jìn)一步降解成小肽，有可能造成抗氧化活性的下降[25]。

圖10 胃腸模擬消化對蛋白肽穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of simulated gastrointestinal digestion on stability of protein peptide

3 結(jié)果與討論

本文以鮐魚為原料，優(yōu)化鮐魚蛋白肽制備工藝，并對其氨基酸組成、抗氧化活性和穩(wěn)定性進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，所制備的鮐魚蛋白肽相對分子質(zhì)量<1 kDa組分占總量的92.15%；該蛋白肽中人體必需氨基酸占比40.10%、具有給質(zhì)子能力的氨基酸占比40.06%、疏水性氨基酸占比35.33%；其清除·OH、ABTS陽離子自由基和DPPH自由基的IC50值分別為3.77、14.14、8.91 mg/mL，具有較高的抗氧化活性。鮐魚蛋白肽在酸性條件和高溫條件下較為穩(wěn)定；在一定添加范圍內(nèi)，食用糖和食品添加劑對鮐魚蛋白肽的活性無顯著性影響(P>0.05)；而隨著NaCl濃度上升，鮐魚蛋白肽抗氧化活性顯著下降(P<0.05)；胃液模擬消化無顯著性影響(P>0.05)，腸液模擬消化對其穩(wěn)定性影響顯著(P<0.05)，經(jīng)胃腸模擬消化后鮐魚蛋白肽仍能保持30.93%的活性。綜上所述，鮐魚蛋白肽抗氧化活性較高，穩(wěn)定性較好，開發(fā)潛力較大，具有良好的應(yīng)用前景，本實(shí)驗(yàn)為鮐魚的精深加工和高效利用提供了一定理論依據(jù)。