不同糖化發(fā)酵劑釀造復(fù)合香型白酒工藝研究

鄭偉，薛江林,,，張煉，楊貴,，范宏筠，楊艷，張煜亮，宋攀，陳吉，母娟，何躍，潘明，張宿義,*

1(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州，646000)2(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)3(瀘州國寶天釀集團股份有限公司，四川 瀘州，646000)

中國白酒最初有濃香、醬香、清香、米香等4種基本香型，為了使釀造的基礎(chǔ)酒口感更加綿柔細(xì)膩、層級豐滿[1-2]，白酒釀造工藝逐漸在四大香型白酒的基礎(chǔ)上復(fù)合發(fā)展到如今的12種香型。目前復(fù)合香型白酒的研究主要集中在濃香與醬香的融合。基于濃香型白酒釀造工藝，結(jié)合醬香型、清香型白酒工藝的復(fù)合香型白酒研究，行業(yè)內(nèi)一直在探索前進。

現(xiàn)階段濃香型白酒的產(chǎn)量占比高、市場需求大，占我國白酒市場份額70%以上，且生產(chǎn)區(qū)域廣泛，具有芳香濃郁、綿柔甘冽、香味協(xié)調(diào)、入口甜、落口綿、尾凈余長等風(fēng)格[3]。為滿足市場需求，通過融合多香型工藝生產(chǎn)復(fù)合香型白酒，迎合消費者的口感喜好，提升白酒風(fēng)味口感是未來中國白酒發(fā)展的方向之一[4-6]。白酒生產(chǎn)的工藝、原料、糖化發(fā)酵劑、環(huán)境是決定白酒質(zhì)量和風(fēng)格特征的關(guān)鍵因素[7-8]。不同香型的白酒具有其獨特的生產(chǎn)工藝，而糖化發(fā)酵劑是白酒發(fā)酵的動力，其質(zhì)量和種類直接關(guān)系到基礎(chǔ)酒的口感風(fēng)味和產(chǎn)量。本文結(jié)合濃香型和醬香型白酒生產(chǎn)工藝，進行復(fù)合香型白酒工藝研究，通過監(jiān)測堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵后糟醅的溫度及理化指標(biāo)的變化，探究不同糖化發(fā)酵劑對白酒質(zhì)量和風(fēng)味的影響。利用第二代高通量測序技術(shù)檢測堆積和發(fā)酵前后糟醅微生物種類及豐度變化，探究不同糖化發(fā)酵劑對糟醅微生物的影響。采用頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析基礎(chǔ)酒中的風(fēng)味物質(zhì)，并由專業(yè)的嘗評員進行感官品評，綜合評定使用不同糖化發(fā)酵劑添加方案對復(fù)合香型白酒產(chǎn)量和質(zhì)量的影響并選出較優(yōu)方案，以期在傳統(tǒng)中國白酒釀造工藝技術(shù)基礎(chǔ)上，形成復(fù)合香型白酒生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川南糯紅高粱、糠殼，瀘州首龍糧油貿(mào)易有限公司；高溫大曲，貴州省仁懷市酒之骨大曲制造有限公司；河內(nèi)白曲，山東梁山徐坊大曲有限公司；糖化曲，安琪酵母股份有限公司。

NaOH、鄰苯二甲酸氫鉀、鹽酸、無水碳酸鈉、無水乙醇；乙醇、叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸、乙醛等，均為色譜純，上海聚合化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，德國賽多利斯公司；酒精計，北京百萬電子科技有限公司；SP-756P紫外可見分光光度計，上海屹譜儀器有限公司；MLS-375L全自動滅菌鍋，日本日立公司；DHG-9245A烘箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DL-1電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機，德國艾本德公司；GC/MS-QP2020氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；TL2010S中通量組織研磨儀，北京鼎昊源科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復(fù)合香型白酒生產(chǎn)工藝流程及操作要點

以粉碎高粱為原料，以瀘州某酒廠濃香釀酒車間糧糟為母糟，進行續(xù)糟配料、混蒸混燒、分層蒸酒、攤晾下曲、高溫堆積、糖化發(fā)酵劑分別采用高溫大曲+河內(nèi)白曲和高溫大曲+糖化曲2種實驗方案(以下簡稱F1和F2)，入泥底石窖發(fā)酵30 d，發(fā)酵結(jié)束后掐頭去尾摘取中段酒進行理化分析及口感嘗評。具體工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flow chart

1.3.2 分析方法

理化指標(biāo)測定方法參考《瀘型酒技藝大全》[9]。

取樣：同時跟蹤相鄰2口大小(3.2 m×2.4 m×1.8 m)一樣的窖池，按五點取樣法分別取糟醅堆積前后以及發(fā)酵結(jié)束后的糟樣500 g，將所取糟醅混合均勻后分成2份，一份用作常規(guī)理化分析，另一份-80 ℃冰箱保存，用于提取總DNA。

基礎(chǔ)酒主體風(fēng)味成分分析、酒精度、總酸以及總酯的含量測定參考國標(biāo)GB/T 10781.1—2021《白酒質(zhì)量要求 第一部分：濃香型白酒》。

白酒感官品評方法參考國標(biāo)GB/T 33404—2016《白酒感官品評導(dǎo)則》、GB/T 33405—2016《白酒感官品評術(shù)語》。

微生物總DNA提取方法參考文獻[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化及感官指標(biāo)變化分析

因方案F1和F2的母糟是經(jīng)過統(tǒng)一混勻后再添加糖化劑和麩皮，然后進入釀造過程，故從圖2可見，在堆積前糟醅的理化特性雖存在顯著性差異，但從堆積開始至發(fā)酵結(jié)束2種方案變化趨勢一致。其中酸度、淀粉含量以及水分含量都出現(xiàn)一定程度的下降；酸度下降的原因可能是堆積過程中，微生物新陳代謝消耗了部分有機酸，或者易揮發(fā)性酸在堆積高溫條件下?lián)]發(fā)。雖然淀粉水解會產(chǎn)生一定水分，但由于堆積溫度的增加，使得部分水分不斷揮發(fā)，同時微生物大量生長繁殖，需要攝取糟醅中的水分[11]，所以水分含量在該過程變化不明顯。淀粉含量減少是因為一部分被堆積糟醅中大量的霉菌生長代謝產(chǎn)生的淀粉酶水解，一部分被微生物的生長繁殖所消耗；此外，在發(fā)酵結(jié)束后，淀粉不斷被微生物代謝，使得在淀粉含量繼續(xù)降低的同時糟醅酸度和水分出現(xiàn)增長。同時，對比2個方案可以發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵階段，F(xiàn)1比F2產(chǎn)酸更多，而淀粉利用率卻更小，這與后文中F1相較于F2的原酒中總酸更高、出酒率更低相一致。

a-酸度；b-淀粉含量；c-水分含量圖2 糟醅理化性質(zhì)對比分析Fig.2 Physical and chemical properties of different fermented grains注：D、R、C分別表示堆積前、堆積后、發(fā)酵后；1、2分別表示F1、F2方案(下同)

在堆積過程中，2個方案的糟醅上堆溫度28.4～29.2 ℃，堆積時間72 h，堆積頂溫48.5～51.2 ℃。如圖3所示，不同堆積時間，糟醅表面呈現(xiàn)的狀態(tài)有明顯差異；當(dāng)糟醅堆積頂溫達50 ℃左右，表層長滿白色菌絲，將手插入其中，能明顯感受到其熱度，此時需要進行破堆入窖，入窖糟醅顏色為深褐色，且?guī)в泄銡馕?。根?jù)2個方案糟醅堆積升溫情況(至48～52 ℃)和堆積糟醅菌絲生長情況(2～3 cm)來判斷，2個方案組的糟醅堆積升溫情況都較為理想，其中F2組糟醅堆積反應(yīng)較F1組糟醅堆積效果更好，堆積前后的酸度都有所下降，其中F2組糟醅酸度下降幅度高于F1組，說明添加糖化曲的糟醅在堆積過程中有機酸類物質(zhì)利用率更高。

高溫堆積工藝使糟醅能夠網(wǎng)羅富集周圍環(huán)境中的微生物，促進其糖化、酯化等一系列化學(xué)反應(yīng)的進行，達到二次制曲的目的，并產(chǎn)生醬香型白酒風(fēng)味，堆積后的糟醅除感官上有著較大的變化外，其所含的營養(yǎng)物質(zhì)、微量成分以及微生物等同樣有所改變。在堆積發(fā)酵期間嗜熱芽胞桿菌等有益于糟醅生香的嗜熱、嗜溫微生物會大量繁殖，為后續(xù)的入窖發(fā)酵提供充足的微生物[6,12-13]。

a-堆積0 h；b-堆積36 h；c-堆積48 h圖3 糟醅發(fā)酵過程中糟醅變化情況Fig.3 Appearances of fermented grains during stacking fermentation

2.2 糟醅發(fā)酵過程中溫度變化趨勢

如圖4所示，入窖溫度控制在28～30 ℃，升溫幅度在10 ℃左右，發(fā)酵溫度整體符合“前緩-中挺-后緩落”的趨勢，其中前2輪發(fā)酵溫度升高較快，推測是由于第1～2輪發(fā)酵在熱季進行，環(huán)境溫度較高引起；其次，因該復(fù)合香白酒釀造過程中還加有高溫大曲，故發(fā)酵溫度主要以高溫大曲為主，從而2種方案溫度變化差異并不顯著。入窖發(fā)酵3～4 d，微生物利用糟醅中帶入的O2快速繁殖產(chǎn)生熱量，使窖內(nèi)發(fā)酵溫度在15～20 d一直保持在30～36 ℃，在此期間，糖化所產(chǎn)生的葡萄糖與酵母菌維持生命所需的葡萄糖基本平衡，發(fā)酵基本停止，酵母菌逐漸衰老死亡，而細(xì)菌和其他微生物生長占優(yōu)勢[14]，此時酒精含量、酸度、淀粉變化不大。入窖第20～30天，酒精發(fā)酵基本完成，隨著發(fā)酵時間的延長，有機酸增加，從入窖第20～30天至開窖，窖內(nèi)處于溫度緩慢下降的產(chǎn)酯期，也是香味物質(zhì)逐漸生成的時期[15]。此時酵母菌已失去活力，主要是細(xì)菌作用產(chǎn)酸，發(fā)酵糟中醇類與有機酸發(fā)生酯化反應(yīng)，酒精含量稍有下降，酸度逐漸上升，微生物細(xì)胞中所含酯化酶促使酯類物質(zhì)生成，能促進糟醅產(chǎn)生較多的風(fēng)味物質(zhì)[16-17]。

a-第1輪發(fā)酵；b-第2輪發(fā)酵；c-第3輪發(fā)酵圖4 糟醅發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度的變化Fig.4 Changes in fermentation temperature during the fermentation process of fermented grains

2.3 堆積前、后和發(fā)酵結(jié)束糟醅微生物多樣性的特征分析

糟醅原核微生物群落組成(<1%合并為Others)如圖5-a所示，整體上來看，2種方案優(yōu)勢微生物都為醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)以及芽胞桿菌屬(Bacillus)等；不同方案中共檢出14種優(yōu)勢細(xì)菌，因河內(nèi)白曲和糖化曲2種曲藥都是以真核微生物為優(yōu)勢微生物，故2種方案在細(xì)菌種類組成上較為相似，但豐度存在差異。通過對比堆積前糟醅樣D1和D2發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有相似性，但D2中克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)豐度顯著高于D1，可能是由糖化發(fā)酵劑引入所致；對比堆積后糟醅樣R1和R2，兩者原核微生物群落結(jié)構(gòu)趨于一致，可能是由于堆積過程中兩者都加麩皮，提高了糟醅疏松度和含氧量，好氧微生物的豐度顯著增加[18]；該現(xiàn)象表明麩皮在調(diào)味酒釀造過程中影響顯著。另外，在F2發(fā)酵結(jié)束糟醅樣本C2中還存在一定量的Acetobacter，這可能是由于麩皮的增氧特性或者是糖化曲對該發(fā)酵體系產(chǎn)生的影響使得整體酸度下降(圖2-a)，從而減輕了對Acetobacter的抑制，使其參與整個釀造過程；原核微生物多樣性分析結(jié)果表明，在整個釀造過程中，2種方案的糟醅發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受河內(nèi)白曲和糖化曲的影響較小，受高溫大曲影響較大。

糟醅真核微生物群落組成(<1%合并為Others)如圖5-b所示，不同方案中共檢出20種優(yōu)勢真菌，真菌種類和豐度都存在顯著差異。在堆積前，方案F1的真菌優(yōu)勢微生物為嗜熱真菌屬(Thermomyces89%)；方案F2為絲衣霉屬(Byssochlamys12%)、Thermomyces31%、曲霉屬(Aspergillus16%)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus30%)。堆積后，方案F1的優(yōu)勢微生物主要為酵母，包括伊薩酵母屬(Issatchenkia29%)、畢赤酵母屬(Pichia29%)以及哈薩克斯坦酵母屬(Kazachstania25%)；而方案F2的優(yōu)勢微生物主要為霉菌，主要為Byssochlamys87%。發(fā)酵結(jié)束后，不同方案糟醅中真菌微生物種類基本一致，但其豐度不同；方案F1優(yōu)勢微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包括Byssochlamys8.8%、Thermomyces2.6%、Aspergillus7.9%、Issatchenkia27%、Pichia15%、青霉屬(Penicillium4.2%)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia7.4%)、Thermoascus3.1%；方案F2優(yōu)勢微生物包括Byssochlamys14%、Aspergillus6%和Penicillium52%。可見，不同糖化發(fā)酵劑對整個發(fā)酵過程真菌群落結(jié)構(gòu)的影響不盡相同，F(xiàn)1中真菌主要集中在酵母屬，F(xiàn)2中真菌主要集中在霉菌屬[19]。

a-細(xì)菌；b-真菌圖5 堆積前、堆積后、發(fā)酵后糟醅微生物多樣性Fig.5 Microbial diversity of fermented grains before stacking,after stacking and after fermentation

2.4 基礎(chǔ)酒產(chǎn)酒率及特征風(fēng)味物質(zhì)分析

對2個實驗方案進行蒸餾取酒，分級儲存。綜合酒樣色譜數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 基礎(chǔ)酒產(chǎn)酒率及色譜數(shù)據(jù)理化指標(biāo)分析Table 1 An analysis of yield, chromatographic data, and physical and chemical index of basic liquor

2個實驗方案3輪次發(fā)酵的平均出酒率分別為F1(29.33±1.27)%、F2(30.2±1.72)%。由表1可見，四大酯中，乙酸乙酯含量最高，其次是乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯；己酸乙酯賦予基礎(chǔ)酒濃香型酒風(fēng)格特點，乙酸乙酯賦予基礎(chǔ)酒清香型風(fēng)格特點，綜合其他酸酯物質(zhì)使得基礎(chǔ)酒的口感復(fù)合綿甜，豐滿協(xié)調(diào)[20-22]。方案F1中，隨著發(fā)酵輪次的增加，總酸含量逐漸降低，總體維持在(2.79±0.92)g/L。方案F2酸度逐漸增加，總體維持在(2.72±0.35)g/L；另外，對于酯類物質(zhì)而言，2種方案都呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，分別維持在(10.27±2.25)、(10.14±2.63)g/L，推測與糖化發(fā)酵劑中真菌微生物的種類相關(guān)。

2.5 基礎(chǔ)酒品評結(jié)果分析

公司嘗評委員會就2個實驗方案3個輪次共6個綜合酒樣進行感官品評，嘗評委員會由2名國家級白酒評委，4名省級評委組成，白酒感官品評嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 33404—2016進行，評分細(xì)則主要包括色澤(5分)、香氣(25分)、口感(60分)、風(fēng)格(10分)4個方面。嘗評委員會給出的綜合平均結(jié)果如表2所示。

表2 基礎(chǔ)酒綜合樣對比品評記錄表Table 2 Comparison and evaluation record of comprehensive samples of basic liquor

結(jié)合基礎(chǔ)酒的品評結(jié)果，經(jīng)過高溫堆積后入窖發(fā)酵，結(jié)合了醬、濃香工藝的基礎(chǔ)酒在香氣、口味、口感、酒體、風(fēng)格等方面融合了醬、濃兩香型之長，特點突出。酒體皆表現(xiàn)為無色或微黃透明，特別是在貯存6個月及一年以后，F(xiàn)2的基礎(chǔ)酒相較于F1酒體而言，顏色更顯微黃，口味醇厚綿甜、豐滿協(xié)調(diào)、回味悠長、還帶有一定醬味，具有舒適優(yōu)雅的復(fù)合香氣。專家總體評價表明，F(xiàn)1方案基礎(chǔ)酒在香氣和風(fēng)格比F2方案基礎(chǔ)酒更為突出。

3 結(jié)果與討論

不同糖化發(fā)酵劑釀造特殊風(fēng)格白酒工藝，結(jié)合了濃香型白酒的續(xù)糟配料工藝、醬香型白酒的高溫堆積等關(guān)鍵工藝特點，通過對復(fù)合香型白酒釀造過程中發(fā)酵溫度的持續(xù)性監(jiān)測，以及對糟醅堆積前、堆積后和發(fā)酵結(jié)束后糟醅進行高通量測序并分析微生物多樣性，結(jié)果表明2種方案在釀造過程中，理化指標(biāo)變化趨勢一致，且方案F1釀造過程中理化指標(biāo)變化差異更明顯；糟醅發(fā)酵溫度都呈現(xiàn)“前緩、中挺、后緩落”的趨勢，區(qū)別在于不同輪次因季節(jié)差異，導(dǎo)致發(fā)酵前期升溫速度不同，但總體升溫幅度都在10 ℃左右；添加河內(nèi)白曲(F1)和糖化曲(F2)的基礎(chǔ)酒出酒率分別為(29.33±1.27)%、(30.2±1.72)%，總酸分別為(2.79±0.92)、(2.72±0.35)g/L，總酯分別為(10.27±2.25)、(10.14±2.63)g/L；感官評價表明2種方案所釀基礎(chǔ)酒在香氣、口味、口感等方面都較為突出，其中F2方案的基礎(chǔ)酒優(yōu)于F1方案。通過對第3輪堆積前、入窖和出窖糟醅進行微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，2種方案在整個釀造過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，真菌結(jié)構(gòu)差異顯著；最終結(jié)合專家組對于基礎(chǔ)酒綜合評分得出添加糖化曲的方案在香氣和風(fēng)格更為突出，總體評價更高。以上結(jié)果表明不同香型白酒釀酒工藝的相互借鑒融合，不同糖化發(fā)酵劑的配比使用，在提升基礎(chǔ)酒質(zhì)量和生產(chǎn)口感豐富的復(fù)合香型白酒方面具有一定效果。