鈍齒棒桿菌異源表達(dá)乙酰輔酶A合成酶對(duì)L-精氨酸合成的影響

吳潔琴，石電，徐華，張顯，楊套偉，徐美娟，饒志明

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

L-精氨酸在醫(yī)藥、畜牧等行業(yè)扮演重要角色[1]。隨著遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，代謝工程改造被廣泛應(yīng)用于L-精氨酸高產(chǎn)菌株的選育中，使得L-精氨酸生產(chǎn)菌株的產(chǎn)率得到了極大的提高[2]。鈍齒棒桿菌(Corynebacteriumcrenatum)不僅是L-脯氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸、L-谷氨酸的生產(chǎn)菌，也是L-精氨酸的優(yōu)勢(shì)菌株。如圖1所示，鈍齒棒桿菌以葡萄糖為碳源轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，然后乙酰輔酶A經(jīng)過(guò)三羧酸循環(huán)等代謝途徑后轉(zhuǎn)化成前體L-谷氨酸，L-谷氨酸通過(guò)位于同一基因簇上精氨酸主合成途徑所有酶的編碼argCJBDFRGH基因簇來(lái)催化合成L-精氨酸。在精氨酸合成途徑中，乙酰輔酶A連接著糖酵解、三羧酸循環(huán)、氨基酸合成等重要代謝途徑，是微生物代謝的重要中心樞紐[3]。乙酰輔酶A可以通過(guò)pta基因編碼的磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶及ack基因編碼的乙酸激酶合成乙酸，由于乙酸含量的積累，不僅會(huì)影響鈍齒棒桿菌的生長(zhǎng)代謝能力，也會(huì)降低乙酰輔酶A通量和L-精氨酸產(chǎn)率[4]。

圖1 鈍齒棒桿菌SYPA5-5中L-精氨酸氨酸合成途徑Fig.1 L-arginine biosynthesis pathway in C. crenatum SYPA5-5

在代謝工程中，針對(duì)乙酰輔酶A通量調(diào)控的常見(jiàn)方法是通過(guò)乙酸途徑[5]，將乙酸途徑合成基因敲除后，既能夠降低乙酸對(duì)菌體的毒害作用，又能提高乙酰輔酶A合成。早期研究發(fā)現(xiàn)，pta-ack基因敲除后增強(qiáng)了乙酰輔酶A的通量，但同時(shí)也會(huì)增加副產(chǎn)物D-乳酸的含量，影響菌株的生長(zhǎng)[6]，其原因是由于乙酰輔酶A合成乙酸，是ATP的來(lái)源途徑之一，且乙酸合成途徑產(chǎn)物乙酰磷酸也是細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，敲除乙酸合成途徑會(huì)影響流向乙酰輔酶A和丙酮酸的代謝流途徑[7]。因此，如何通過(guò)改造乙酸生產(chǎn)途徑調(diào)控乙酸與乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，是生產(chǎn)與輔酶A(coenzyme A,CoA)相關(guān)生物化學(xué)品的研究熱點(diǎn)。ZHA等[8]在大腸桿菌中通過(guò)過(guò)表達(dá)乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthetases，ACS)，提高了乙酸流向乙酰輔酶A通量，將丙二酰輔酶A合成產(chǎn)率提高了4倍多。XIAO等[9]發(fā)現(xiàn)，乙酸能夠通過(guò)ACS轉(zhuǎn)化生成乙酰輔酶A，他們?cè)诖竽c桿菌內(nèi)表達(dá)ACS，有效利用乙酸使脂肪酸達(dá)到0.9 g/L。綜上所述，過(guò)表達(dá)ACS是增強(qiáng)乙酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化有效策略之一。

在大腸桿菌和枯草芽胞桿菌中有1個(gè)ACS[10]，巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)內(nèi)有2個(gè)ACS，分別為ACS1和ACS2[11]。本研究分別克隆表達(dá)了來(lái)自于EscherichiacoliBL21、Bacillussubtilissubsp.subtilis str.168及AcetobacterpasteurianusATCC 33445中的基因acs。將4種ACS克隆表達(dá)后，測(cè)定酶的pH和溫度穩(wěn)定性，選擇最佳酶活性的來(lái)源巴氏醋酸桿菌中的ACS編碼基因Apacs1，構(gòu)建重組菌株SYPA5-5/pXMJ19-Apacs1(命名為SYPA-ACS)，在C.crenatum中強(qiáng)化ACS的表達(dá)，測(cè)定重組菌株SYPA-ACS發(fā)酵產(chǎn)精氨酸的能力。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

CorynebacteriumcrenatumSYPA5-5是由本實(shí)驗(yàn)室保藏[12]的L-精氨酸生產(chǎn)菌株；EscherichiacoliBL21用于擴(kuò)增基因Ecacs、Bacillussubtilissubsp.subtilis168用于擴(kuò)增基因Bsacs，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；AcetobacterpasteurianusATCC 33445，購(gòu)于ATCC工業(yè)微生物菌種保藏中心，用于擴(kuò)增基因Apacs1和Apacs2；JM109，上海生物工程有限公司；質(zhì)粒pET28a和pXMJ19，大連生物工程有限公司；重組質(zhì)粒pET28a-Ecacs、pET28a-Bsacs、pET28a-Apacs1、pET28a-Apacs2、pXMJ19-Apacs1，均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，使用的菌株、質(zhì)粒及引物見(jiàn)表1和表2。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用到的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 工具酶與試劑

質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒，上海生物工程有限公司；ATP檢測(cè)試劑盒、NAD+/NADH、NADP+/NADPH檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乙酰輔酶A(acetyl-CoA)含量測(cè)定試劑盒，齊源生物有限公司；乙酸鹽檢測(cè)試劑盒，金畔生物有限公司；taqDNA聚合酶、ExtaqDNA聚合酶、Primer StarDNA聚合酶、Hind Ⅲ、XbaI、EcoR I 限制性內(nèi)切核酸酶，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；蘋(píng)果酸脫氫酶、檸檬酸合酶、L-蘋(píng)果酸、CoA、ATP、NAD+，索萊寶科技有限公司；L-精氨酸、乙酸鉀，阿拉丁生物試劑公司；其余所用試劑均來(lái)自于國(guó)藥集團(tuán)化試劑有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

PCR儀、電轉(zhuǎn)儀，德國(guó)Eppendorf公司；凝膠成像儀，英國(guó)UVP有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；往復(fù)式搖床，上海智誠(chéng)有限公司；UV2000分光光度計(jì)，UNIC(上海)儀器有限公司；SBA-40C生物傳感器，山東省科學(xué)院生物研究所；5 L發(fā)酵罐，Biotech上海保興生物設(shè)備工程有限公司；1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，酵母粉5，蛋白胨10，pH 7.0。

醋酸桿菌培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉10，pH 5.5，滅菌后加入無(wú)水乙醇40 mL。

鈍齒棒桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)培養(yǎng)基(g/L)：吐溫-80 100 μL，NaCl 10，蛋白胨10，甘氨酸3，酵母粉5。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉20，葡萄糖40，(NH4)2SO425，MgSO4·7H2O 1，KH2PO41.5，用氨水調(diào)pH至7.2。

搖瓶培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉20，葡萄糖120，(NH4)2SO440，MnSO40.02，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.5，CaCO320，用氨水調(diào) pH至 7.2。葡萄糖與其他成分分開(kāi)滅菌。

5 L發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉20，葡萄糖80，(NH4)2SO440，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.5，MnSO40.02，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，用氨水調(diào)pH至7.2。

所有培養(yǎng)基均115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：將鈍齒棒桿菌菌株活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)96 h后測(cè)定發(fā)酵液產(chǎn)量。5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.5 不同來(lái)源的乙酰輔酶合成酶的篩選及酶學(xué)性質(zhì)

1.5.1 乙酰輔酶合成酶表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)BRENDA酶數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI基因組信息數(shù)據(jù)庫(kù)分析，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已有的菌株，分別以E.coliBL21、B.subtilissubsp．subtilisstr．168和A.pasteurianusATCC 33445的基因組為模板，采用Primer StarDNA擴(kuò)增基因ECacs、Bsacs、Apacs1和Apacs2，回收目的擴(kuò)增片段，目的片段再連接到線性質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。

1.5.2 乙酰輔酶合成酶的表達(dá)與純化

構(gòu)建成功的重組大腸桿菌活化后接種于10 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)8～12 h，然后轉(zhuǎn)接至50 mL搖瓶中，培養(yǎng)菌液OD600值為0.8～1.0左右時(shí)，加入0.5 mmol/L的IPTG溶液，16 ℃下過(guò)夜誘導(dǎo)。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體細(xì)胞，用PBS懸浮細(xì)胞菌體2次后，最后加入5 mL PBS懸浮菌體。破碎懸浮細(xì)胞溶液直至菌液澄清，4 ℃、12 000 r/min離心20 min分離上清液與細(xì)胞沉淀，上清液通過(guò)SDS-PAGE來(lái)驗(yàn)證目的蛋白質(zhì)[14]，分析目標(biāo)蛋白表達(dá)情況以及進(jìn)行后續(xù)的酶活性測(cè)定或蛋白純化實(shí)驗(yàn)。利用His-Trap HP 純化柱純化目的蛋白[15]，利用牛血清血蛋白測(cè)定蛋白濃度[16]。

1.5.3 ACS活性測(cè)定

將純化后的4種不同來(lái)源的ACS進(jìn)行酶活力測(cè)定[17]。1 mL反應(yīng)體系包含：100 μmol Tris-HCl(pH 7.4)、10 μmolL-蘋(píng)果酸、10 μmol MgCl2、1 μmol NAD+、0.2 μmol CoA、3 U蘋(píng)果酸脫氫酶、43.3 U檸檬酸合酶、10 μmol乙酸鉀、10 μmol ATP、100 μL的純化酶液，加入ATP開(kāi)始反應(yīng)。在檸檬酸合酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的作用下，能夠?qū)⒁阴］o酶A的生成率與NADH的生成率關(guān)聯(lián)起來(lái)，通過(guò)分析340 nm處的NADH的生成率，確定ACS的酶活力。

1.5.4 酶學(xué)性質(zhì)的研究

酶的最適pH及溫度確定：將緩沖液設(shè)定為不同pH，測(cè)定ACS最適反應(yīng)pH；在不同梯度溫度條件下，測(cè)定最適溫度，最高酶活力定義為100%。溫度穩(wěn)定性研究：將緩沖液置于不同溫度下(20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃)，加入酶液后，測(cè)定相對(duì)酶活力。pH穩(wěn)定性研究：將緩沖液設(shè)定為不同的pH條件(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10)，加入純酶液，孵育30 min,測(cè)定相對(duì)酶活力，初始酶活力定義為100%。溫度穩(wěn)定性研究：將4種ACS純酶液分別置于不同溫度(20、30、40、50、60 °C)，溫浴1 h后測(cè)定殘余酶活力，將初始測(cè)定的酶活力設(shè)置為100%。動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究：改變底物濃度(分別為5、10、20、40、60、80、100 mmol/L)，測(cè)定酶活力。以Hill方程V=Vmax(Sn)/(Kn+Sn)進(jìn)行線性擬合。

1.6 重組鈍齒棒桿菌SYPA-ACS的構(gòu)建

選擇最優(yōu)來(lái)源的ACS編碼基因acs，用限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒載體pXMJ19，經(jīng)純化試劑盒回收后與目的擴(kuò)增基因酶連接，獲得重組質(zhì)粒利用電轉(zhuǎn)化入SYPA5-5感受態(tài)中[18]。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單菌落，利用引物P19-F、P19-R進(jìn)行驗(yàn)證分析，將構(gòu)建成功的重組鈍齒棒桿菌菌株SYPA5-5/pXMJ19-Apacs1(命名為SYPA-ACS)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6 發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定

1.6.1 菌體生物量的測(cè)定

取定量的發(fā)酵液，用0.125 mol/L HCl溶液去除發(fā)酵液中的CaCO3沉淀后，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液在562 nm處細(xì)菌OD值，細(xì)菌干重(dry cell weight,DCW)與細(xì)菌OD562值的關(guān)系為OD562=0.375 g/L DCW[19]即OD562=1時(shí)，DCW為0.375 g/L。

1.6.2 葡萄糖含量的測(cè)定

將定量發(fā)酵液離心后取上清液，利用生物傳感器測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的含量。

1.6.3 乙酸含量的測(cè)定

取定量發(fā)酵液離心，將上清液稀釋一定倍數(shù)后，采用乙酸鹽檢測(cè)試劑盒測(cè)定發(fā)酵液中乙酸的含量。

1.6.4 游離氨基酸的測(cè)定

將發(fā)酵液離心，取上清液稀釋一定倍數(shù)，采用高效液相色譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源ACS的克隆與表達(dá)

以4種不同的菌株為擴(kuò)增模板，獲得Ecacs、Bsacs、Apacs1、Apacs2基因片段，與線性化pET28a載體進(jìn)行連接，化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)，采用表1中的引物，對(duì)重組菌株進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 959、1 719、1 923、1 989 bp(圖2)，分別對(duì)應(yīng)Ecacs、Bsacs、Apacs1、Apacs2，符合它們的理論大小，通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，成功構(gòu)建了pET28a-Ecacs、pET28a-Bsacs、pET28a-Apacs1、pET28a-Apacs2質(zhì)粒，將構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，驗(yàn)證結(jié)果正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)的BL21/pET28a的菌液經(jīng)超聲波破碎后，取上清液進(jìn)行驗(yàn)證分析。通過(guò)SDS-PAGE分析檢測(cè)到分子質(zhì)量約為71.83、66.06、70.51、72.93 kDa的特異性條帶，如圖3-a所示，不同acs基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。

M-DNA Marker;1-Ecacs;2-Bsacs;3-Apacs2;4-Apacs1;5-pET28a-Ecacs;6-pET28a-Bsacs;7-pET28a-Apacs2;8-pET28a-Apacs1a-目的基因PCR擴(kuò)增驗(yàn)證電泳圖譜；b-重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證電泳圖譜圖2 acs基因的PCR及質(zhì)粒pET28a-acs酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 PCR results of acs genes and identification of pET28a-acs plasmids and pET28a plasmid by double enzyme digestion

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;1-pET28a;2-pET28a-Ecacs;3-pET28a-Bsacs;4-pET28a-Apacs2;5-pET28a-Apacs1;6-pET28a-Ecacs;7-pET28a-Bsacs;8-pET28a-Apacs2;9-pET28a-Apacs1a-重組大腸桿菌E.coli BL21/pET28a-acs細(xì)胞破碎上清液；b-重組大腸桿菌E.coli BL21/pET28a-acs細(xì)胞破碎上清液純化后圖3 重組菌株粗蛋白及ACS純化SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of crude proteins and purification

純化后測(cè)定ACS活力，測(cè)定結(jié)果如表3所示，ACS酶液活力為328.44、50.44、784.59、119.93 U/mL，表明4種來(lái)源的ACS中，A.pasteurianus來(lái)源的ACS1酶活力最高，對(duì)底物乙酸鉀親和力也更高。

表3 本實(shí)驗(yàn)涉及的ACS重組酶的酶學(xué)性質(zhì)Table 3 Enzymatic properties of recombinant enzymes used in this study

2.2 ACS的酶學(xué)性質(zhì)的研究

ACS的最適溫度結(jié)果如圖4-a所示，4種不同ACS最適溫度均在30～40 ℃范圍內(nèi)，然而隨著反應(yīng)溫度的升高，ACS的酶活力也會(huì)逐漸上升，當(dāng)溫度超過(guò)一定范圍后，酶的催化能力反而會(huì)下降，其原因是隨著溫度的上升，ACS蛋白失活，ACS基本沒(méi)有了催化活性。ACS的最適pH見(jiàn)圖4-b，在pH 7.0～8.0范圍內(nèi)，4種不同ACS的均為最適反應(yīng)，隨著緩沖液pH的增高，ACS的酶催化能力也逐漸下降。ACS的溫度穩(wěn)定性結(jié)果如圖4-c所示，4種不同ACS在20～40 ℃均有較好的溫度穩(wěn)定性，1 h后的殘余酶活力仍在50%以上，其中ApACS1的溫度穩(wěn)定性明顯優(yōu)于其他3種ACS。ACS的反應(yīng)pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖4-d所示，ApACS1的pH穩(wěn)定性明顯優(yōu)于其他3種ACS，在pH 5.0～9.0孵育30 min，仍能保持50%的酶活力。綜上所述，ApACS1最適溫度為37 ℃，最適pH為7.0，與其他3種ACS的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性相比，ApACS1穩(wěn)定性更好。

a-最適溫度;b-最適pH;c-最適溫度穩(wěn)定性;d-最適pH穩(wěn)定性圖4 四種ACS 的酶學(xué)性質(zhì)比較Fig.4 Comparison of the properties of four kinds of ACS

2.3 重組鈍齒棒桿菌SYPA-ACS的構(gòu)建

將A.pasteurianus來(lái)源的ACS編碼基因acs1，與線性化質(zhì)粒pXMJ19連接后轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)中，涂布于抗性平板，利用表2的引物進(jìn)行菌落PCR，并進(jìn)行酶切驗(yàn)證。如圖5-a所示，在1 000～2 000 bp有明亮條帶，符合Apacs1長(zhǎng)度大小，在4 000～7 000 bp有明亮條帶，符合pXMJ19線性化后的長(zhǎng)度大小，表明pXMJ19-Apacs1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

提取構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pXMJ19-acs1，電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)SYPA5-5，涂布含有氯霉素抗性平板上，利用引物表2中的引物菌落PCR，驗(yàn)證SYPA-ACS陽(yáng)性菌落。挑選出發(fā)菌株SYPA5-5和SYPA-ACS于培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12 h轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基，誘導(dǎo)后離心收集菌體并破碎，取上清液進(jìn)行驗(yàn)證分析。如圖5-b所示，ApACS1在鈍齒棒桿菌中的表達(dá)大小為70.51 kDa，表明重組質(zhì)粒pXMJ19-acs1在菌株SYPA5-5成功表達(dá)，重組菌株SYPA-ACS構(gòu)建成功。

M-DNA Marker;1-pXMJ19-Apacs1雙酶切;2-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;3-出發(fā)菌株細(xì)胞破碎上清液;4-重組菌株細(xì)胞破碎上清液a-重組質(zhì)粒pXMJ19-Apacs1雙酶切驗(yàn)證;b-重組SYPA 5-5/pXMJ19-Apacs1菌株細(xì)胞破碎上清液圖5 構(gòu)建SYPA 5-5/pXMJ19-Apacs1菌株及重組菌株粗酶液SDS-PAGE分析Fig.5 Construction of SYPA 5-5/pXMJpXMJ19-Apacs1 and SDS-PAGE analysis of the overexpression of ApACS1 in recombinant strains

2.4 SYPA5-5與SYPA-ACS菌株搖瓶發(fā)酵比較

分別測(cè)定SYPA5-5與SYPA-ACS菌株粗酶液中ACS活力，如表4所示，重組菌株SYPA-ACS粗酶液的ACS活力為45.08 U/mL，證明重組菌株SYPA-ACS的ACS表達(dá)量加強(qiáng)。將上述的SYPA5-5與SYPA-ACS菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后轉(zhuǎn)接搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h后，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物參數(shù)。根據(jù)圖6所示，重組菌株SYPA-ACS搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為33.14 g/L，相比較SYPA5-5菌株，產(chǎn)量提高21.39%，乙酸含量為0.836 g/L，與SYPA5-5相比，下降66.41%。利用試劑盒測(cè)定菌株乙酰輔酶A含量，表4顯示，SYPA-ACS菌株乙酰輔酶A含量為3.34 nmol/mg，比SYPA5-5提高了31.6%。以上結(jié)果表明，在鈍齒棒桿菌中過(guò)表達(dá)ACS，能夠有效利用乙酸轉(zhuǎn)化增強(qiáng)乙酰輔酶A的產(chǎn)率，進(jìn)一步提高L-精氨酸產(chǎn)率。

表4 不同菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量Table 4 Shake flask fermentation yield of different strains

為了驗(yàn)證acs1基因的過(guò)表達(dá)對(duì)胞內(nèi)ATP、NADH和NADPH水平的影響，利用試劑盒測(cè)定SYPA5-5和SYPA-ACS菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胞內(nèi)ATP、NADH和NADPH含量，結(jié)果如圖6-b所示。由于acs1基因的過(guò)表達(dá)，SYPA-ACS菌株的胞內(nèi)ATP與NADH水平為4.87、11.01 μmol/g DCW，與出發(fā)SYPA5-5菌株相比分別提高了13.71%、280.67%，同樣，我們也測(cè)量了SYPA-ACS菌株的胞內(nèi)NADPH含量為21.65 μmol/g DCW，相比較原始菌株含量增加了213.61%。由上述結(jié)果可知，利用乙酸提高乙酰輔酶A的含量對(duì)胞內(nèi)ATP、NADH和NADPH提高有顯著的效果，其原因可能是隨著ACS的過(guò)表達(dá)，糖酵解、三羧酸循環(huán)等代謝途徑也隨之增強(qiáng)，伴隨著ATP的合成，同時(shí)也為細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)提供重要物質(zhì)乙酰磷酸，提高了重組菌株中NADH、NADPH含量。由于在L-精氨酸合成途徑中，合成1分子L-精氨酸需要消耗5分子ATP與2分子NADPH，因此，ATP、NADH和NADPH含量提高，也有助于L-精氨酸的合成。

a-SYPA5-5、SYPA-ACS菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量;b-菌株胞內(nèi)ATP、NADH和NADPH含量圖6 鈍齒棒桿菌搖瓶發(fā)酵Fig.6 Shake flask fermentation of strains

2.5 菌株發(fā)酵過(guò)程比較

根據(jù)菌株在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵的結(jié)果可以分析出重組菌株SYPA-ACS產(chǎn)酸能力高于出發(fā)菌株SYPA5-5。如圖7所示，在發(fā)酵培養(yǎng)前期，重組菌株SYPA-ACS的菌株生長(zhǎng)與出發(fā)菌株SYPA5-5相差不大。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間培養(yǎng)穩(wěn)定后，重組菌株SYPA-ACS的菌體量明顯高于出發(fā)菌株。40～96 h是菌體積累L-精氨酸的重要時(shí)期，此時(shí)重組菌株SYPA-ACS發(fā)酵產(chǎn)酸能力相對(duì)出發(fā)菌株SYPA5-5優(yōu)勢(shì)較為明顯，L-精氨酸的合成產(chǎn)量更高。如圖7所示，發(fā)酵穩(wěn)定期SYPA-ACS的產(chǎn)量達(dá)到53.43 g/L，比出發(fā)菌株41.91 g/L，提高了25.72%，產(chǎn)率0.577 g/(L·h)。綜上，通過(guò)異源表達(dá)ACS，增加了乙酸的轉(zhuǎn)化率，不僅利用了乙酸，減少了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)毒害作用，同時(shí)提高了乙酰輔酶A的通量，加強(qiáng)了菌株合成L-精氨酸的能力。

圖7 SYPA-ACS菌株 5 L發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸性能測(cè)定Fig.7 Fermentation performance of L-arginine producing SYPA-ACS strains in 5 L fermenter

3 討論

本文首先對(duì)合成乙酰輔酶A進(jìn)行篩選，對(duì)4種不同ACS編碼基因acs進(jìn)行克隆表達(dá)，并且對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較。巴氏醋酸桿菌來(lái)源的ACS最高活力為784.59 U/mL。ApACS1最適反應(yīng)pH為7.0，最適反應(yīng)溫度為37 ℃。酶學(xué)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，ApACS1酶活力最高且酶學(xué)穩(wěn)定性更好，因此選擇最適來(lái)源的ACS在鈍齒棒桿菌克隆表達(dá)。鈍齒棒桿菌中異源表達(dá)ApACS1后，在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)研究其L-精氨酸生產(chǎn)性能，SPYA5-5和SYPA-ACS的細(xì)胞干重分別為24.33和26.09 g/L(圖7)，與SPYA5-5相比提高了7.37%，表明過(guò)表達(dá)ACS不會(huì)影響到菌體的生長(zhǎng)速率，并能改善菌體生長(zhǎng)環(huán)境。在發(fā)酵后期，SYPA-ACS菌株發(fā)酵產(chǎn)酸能力相較SPYA5-5提高27.48%，分別為53.43 g/L和41.91 g/L。相較于重組菌株SYPA-ACS，出發(fā)菌株SPYA5-5生長(zhǎng)和產(chǎn)酸并沒(méi)有重組菌株高，其原因由于乙酸的合成，不僅會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用影響菌體生長(zhǎng)，還會(huì)降低胞內(nèi)pH，而菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最適pH為6.5～7.0，且精氨酸的前體物質(zhì)谷氨酸合成的關(guān)鍵酶——谷氨酸脫氫酶在pH中性條件下酶活力最高。當(dāng)培養(yǎng)基pH降到6.5左右時(shí)，谷氨酸脫氫酶活力下降近一半[21]，不僅影響菌體生長(zhǎng)，也不利于細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)代謝調(diào)控合成精氨酸。通過(guò)異源表達(dá)ACS，能有效利用乙酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，提高代謝途徑中的終產(chǎn)物L(fēng)-精氨酸含量，為L(zhǎng)-精氨酸的工業(yè)化提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。