鹽酸二甲胺四環(huán)素用于牙周炎的緩釋原位凝膠新劑型的研究

陳少壯 葉巖榮 沈 赟 劉 佳

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院藥劑科，福建 廈門 361015；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，福建 廈門 361015

牙周病是指在牙周組織發(fā)生的疾病，是導(dǎo)致牙齒脫落的主要原因，同時(shí)也是導(dǎo)致某些疾病的重要因素，如卒中和冠心病等[1]。牙周局部緩釋給藥系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：避免首過效應(yīng)、藥物貯留時(shí)間延長，減少頻繁給藥、與吸收面直接接觸，提高藥物的吸收；維持有效藥物濃度。缺點(diǎn)：給藥時(shí)患者牙周袋意外膨脹[2]；需專門裝置給藥。原位凝膠即在位凝膠，是一類以溶液狀態(tài)給藥后，能在用藥部位立即發(fā)生相轉(zhuǎn)變，由液態(tài)轉(zhuǎn)化形成非化學(xué)交聯(lián)半固體凝膠的制劑。其相轉(zhuǎn)變的方式有溫度敏感[3]、去除溶劑沉淀、酸堿度敏感[4]和離子敏感[5]等多種類型。原位凝膠給藥系統(tǒng)同時(shí)具備了固體植入劑在局部貯留、緩慢釋藥和微粒給藥系統(tǒng)的可注射性的優(yōu)勢(shì)[6]。

鹽酸二甲胺四環(huán)素（minomycin hydrochloride，MINO·HCl）是治療牙周病的主要藥物[7]，其不影響其他組織的新陳代謝。MINO·HCl 有更廣的抗菌譜和更強(qiáng)的抗菌活性[8]，其對(duì)大部分牙周致病菌如牙齦炎桿菌和伴放線桿菌等有明顯的抑制作用[9]。MINO·HCl 能降低牙周炎癥的宿主反應(yīng)，促進(jìn)牙周組織膠原的合成與表達(dá)。

在牙周病原位凝膠給藥系統(tǒng)中加入透明質(zhì)酸具有多方面優(yōu)勢(shì)。透明質(zhì)酸作為一種高分子酸性黏多糖[10]，有多種重要的生理功能，如調(diào)節(jié)血管壁的通透性[11]，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)和促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等。在給藥系統(tǒng)中加入透明質(zhì)酸，可以增大牙周組織細(xì)胞膜的通透性，使藥物達(dá)到更好的吸收率。并且作為高分子聚合物，透明質(zhì)酸溶于水中能夠形成具有一定黏度的膠狀物質(zhì)，可以保護(hù)原位凝膠在相轉(zhuǎn)變初期不被齦溝液所帶出。同時(shí)，在牙周組織的愈合過程中，透明質(zhì)酸也能起到促進(jìn)作用[12]。

因此，本研究根據(jù)去除溶劑沉淀的原理[13]制備緩釋原位凝膠，在牙周袋內(nèi)注射入緩釋原位凝膠，其接觸齦溝液后，溶劑擴(kuò)散并溶于水中，難溶的共聚物沉淀形成凝膠并緩慢釋放藥物，達(dá)到局部治療牙周病的目的，并且該共聚物可生物降解。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

JB-1 型攪拌器（上海雷磁新涇儀器儀器有限公司）；AR124CN 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；BA110S 型電子天平（德國賽多利斯公司）；NDJ-8S型數(shù)字顯示黏度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；JJ-1 型精密增力電動(dòng)攪拌器（常州國華電器有限公司）；UV-2600 型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）

1.2 試劑

MINO·HCl（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：H25J7B9464）；透明質(zhì)酸[（hyaluronic acid，HA)，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：P208761]；N- 乙 烯 基 吡 咯 烷 酮[（N-vinyl-2-pyrrolidone，NVP），美國Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)：122590HH]；N- 甲 基 吡 咯 烷 酮[（N-methyl-2-pyrrolidone，NMP），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：H03556J]；二甲基亞砜[（dimethyl sulfoxide，DMSO），西隴化工股份有限公司，批號(hào)：03A19744]；三乙酸甘油酯[（triacetin，GTA），上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：117632]；聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lacticco-glycolic acid），PLGA50 ∶50，Mw：10000，濟(jì)南岱罡生物材料有限公司，批號(hào)：420892S]；甲基丙烯酸氨烷基酯共聚物E 型（aminoalkyl methacrylate copolymer E，Eudragit?E100，德國羅姆公司，批號(hào)：AKS3402）；磷酸鹽緩沖液[（phosphate buffer solution，PBS），福州科諾生物有限公司，批號(hào)：0039427]；MINO·HCl軟膏（新時(shí)代藥業(yè)有限公司，批號(hào)：AR0862）；甲醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：0103611）。

2 方法

2.1 處方篩選

2.1.1 基質(zhì)的選擇 PLGA50 ∶50 和Eudragit?E100的降解產(chǎn)物對(duì)人體無刺激、無毒，具有良好的生物相容性[14]，因此選用這二者通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行處方篩選。

2.1.2 有機(jī)溶劑的選擇 NMP、NVP、DMSO 和GTA均可與水互溶[15]，且對(duì)人體毒性較低、生物相容性較好，本實(shí)驗(yàn)對(duì)HA、PLGA50 ∶50、Eudragit?E100 在上述四種溶劑中的溶解度進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。分別稱取HA、PLGA50 ∶50、Eudragit?E100 三種物質(zhì)20 mg 于4 個(gè)燒杯中，分別加入20 ml 的有機(jī)溶劑：NMP、NVP、DMSO 和GTA，放置于室溫，觀察溶解情況，并記錄溶解時(shí)間。

2.2 制備工藝

2.2.1 制備的方法 稱取HA 和共聚物分別溶于NVP 和NMP 中攪拌溶解，然后稱取MINO·HCl 加入其中并攪拌溶解，制成MINO·HCl 緩釋原位凝膠。2.2.2 通針性試驗(yàn) 按照“2.2.1”項(xiàng)下的制備方法，MINO·HCl 濃度為10%，用PLGA50 ∶50 和Eudragit?E100 分別制備共聚物濃度為20%和30%的緩釋原位凝膠，通過5 ml 注射器（6 號(hào)針頭）試驗(yàn)兩份原位凝膠的通針性。

2.2.3 凝固情況試驗(yàn) 按照“2.2.1”項(xiàng)下的制備方法，MINO·HCl 濃度為10%，用PLGA50 ∶50 和Eudragit?E100 分別制備共聚物濃度為20%和30%的緩釋原位凝膠，將其分別注射入PBS 中，觀察凝固情況。

2.3 質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 觀察形態(tài) 觀察空白原位凝膠和MINO·HCl 緩釋原位凝膠的外觀形態(tài)。

2.3.2 考察通針性 根據(jù)處方制備3 批MINO·HCl緩釋原位凝膠，通過5 ml 注射器（6 號(hào)針頭）考察其通針性。

2.3.3 黏度測(cè)定 根據(jù)處方制備MINO·HCl 緩釋原位凝膠，室溫條件下使用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)（2 號(hào)轉(zhuǎn)子，60 rpm）來測(cè)定其黏度。

2.4 含量測(cè)定

本含量測(cè)定方法采用紫外分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定。選擇適宜的溶劑將原位凝膠中的MINO·HCl 溶解后，通過紫外分光光度計(jì)，測(cè)定原位凝膠中MINO·HCl 的含量。

2.4.1 波長的選擇 精密稱取2 mg MINO·HCl于100 ml 棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容到刻度，得到濃度為20 μg/ml 的MINO·HCl 溶液，用紫外分光光度計(jì)在200 ～600 nm 下掃描波長。再取適量的空白原位凝膠（約20 mg）于100 ml 的甲醇中充分溶解，取上清液在200 ～600 nm 下掃描波長。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取25 mg MINO·HCl于25 ml 棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，得到濃度1 mg/ml 的儲(chǔ)備液。用甲醇分別稀釋成 濃 度 為6、10、14、18、22、26、30 μg/ml 的 溶 液。以甲醇作為對(duì)照，在檢測(cè)波長下測(cè)定3 次吸光度，計(jì)算平均值。以濃度對(duì)吸光度做線性回歸方程。

2.4.3 樣品含量測(cè)定 根據(jù)處方制備3 批MINO·HCl 緩釋原位凝膠，分別取20 mg 于100 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，超聲30 min使其充分溶解，再取上清液用上述紫外分光光度法測(cè)定3 批緩釋原位凝膠中MINO·HCl 的含量。

2.5 體外釋放研究

通過對(duì)MINO·HCl 緩釋原位凝膠和MINO·HCl軟膏二者體外釋放的比較，對(duì)MINO·HCl 緩釋原位凝膠的體外釋放結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

取MINO·HCl 緩釋原位凝膠和MINO·HCl 軟膏各300 mg 分別加入到含10 ml PBS（0.01 mol/ml，pH 7.4）的西林瓶中，置于恒溫加熱磁力攪拌器，設(shè)定轉(zhuǎn)速為80 rpm，溫度為37℃，分別在2、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 后將西林瓶中液體取出，同時(shí)補(bǔ)充37℃的PBS 10 ml。用甲醇分別將取出的溶液稀釋至合適的濃度后，以同等稀釋倍數(shù)的PBS 為對(duì)照組，于檢測(cè)波長下測(cè)定其吸光度，通過“2.4.2”得到的方程分別計(jì)算二者的濃度和累積釋放百分率，以時(shí)間對(duì)累計(jì)釋放百分率做藥物釋放曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 處方篩選

對(duì)于有機(jī)溶劑的選擇，試驗(yàn)結(jié)果表明，HA 在NVP 中易溶，在NMP、DMSO 和GTA 中均微溶或難溶，見表1。PLGA50 ∶50、Eudragit?E100 在NMP 和DMSO 中均可以較快溶解，在NVP 中溶解較慢，在GTA 中難以溶解，見表2。DMSO 具有強(qiáng)烈的大蒜的難聞氣味，NMP 無難聞氣味，安全無毒，生物相容性良好。因此，選用NMP 作為溶劑，NVP 作為助溶劑。

表1 HA在四種有機(jī)溶劑中的溶解情況

表2 不同共聚物在四種有機(jī)溶劑中溶解所需要的時(shí)間（h）

3.2 制備工藝

3.2.1 通針性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果表明，PLGA50 ∶50和Eudragit?E100 濃 度 為20% 時(shí)，其 通 針 性 較好，且相同濃度下Eudragit?E100 的通針性優(yōu)于PLGA50 ∶50。共聚物的濃度越小，所制成的原位凝膠通針性越好。見表3。

表3 不同原位凝膠的通針性試驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 凝固情況試驗(yàn) PLGA50 ∶50 和Eudragit?E100濃 度 為30% 時(shí)，其 凝 固 速 度 較 快。 且 用PLGA50 ∶50 制成的原位凝膠比用Eudragit?E100制成的原位凝膠在PBS 中凝固更快，成型性更好，骨架更完整。見表4。因此，選擇PLGA50 ∶50 為基質(zhì)，濃度為30%。

表4 不同原位凝膠在磷酸鹽緩沖液中的凝固情況

3.3 質(zhì)量評(píng)價(jià)

3.3.1 觀察形態(tài) 空白原位凝膠為透明黃色液體，色澤均勻，流動(dòng)性良好。見圖1。MINO·HCl 緩釋原位凝膠為均勻的棕色透明液體，加入到PBS 中凝固成凝膠狀固體。見圖2。

圖1 空白原位凝膠

圖2 MINO·HCl 緩釋原位凝膠在磷酸鹽緩沖液中凝固

3.3.2 考察通針性 3 批MINO·HCl 緩釋原位凝膠，均可以通過5 ml 注射器（6 號(hào)針頭），其通針性較好。

3.3.3 黏度測(cè)定 緩釋原位凝膠的黏度為（292.0±5.4）mPa·s，原位凝膠黏度在200 ～300 mPa·s內(nèi)既可以用于注射，也可以保證其在液體中凝固初期不發(fā)生擴(kuò)散，因此其黏度良好，可用于注射。

3.4 含量測(cè)定

3.4.1 波長的選擇 MINO·HCl 在波長344 nm處有最大吸收，其他成分在波長344 nm 處不影響對(duì)MINO·HCl 的測(cè)定，因此波長344 nm 作為MINO·HCl 的測(cè)定波長。見圖3。

圖3 MINO·HCl 和輔料的波長掃描

3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)溶液在不同濃度下測(cè)得的吸光度，得到線性回歸方程：A=0.024C-0.0058，R2=0.9998，MINO·HCl 在6 ～30 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖4。

圖4 紫外分光光度法測(cè)定MINO·HCl 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4.3 樣品含量測(cè)定 測(cè)定的3 批樣品含量分別 為99.79%、99.21% 和100.86%，含 量 范 圍 為（100±1）%，含量均符合要求。

3.5 體外釋放研究

原位凝膠在第1 天有37.40%的快速釋放，之后便可穩(wěn)定持續(xù)地釋放藥物，在第7 天累積釋放達(dá)到90.53%，具有良好的緩釋效果；而MINO·HCl軟膏在第1 天累積釋放便高達(dá)66.97%，在第3 天就達(dá)到了91.71%。因此，MINO·HCl 緩釋原位凝膠具有良好的緩釋作用。見圖5。

圖5 MINO·HCl 緩釋原位凝膠和軟膏的藥物釋放曲線

4 總結(jié)與展望

本研究確定了MINO·HCl 緩釋原位凝膠的處方成分包括：PLGA50 ∶50、MINO·HCl、HA，NMP、NVP；制成了一種能夠以注射給藥的緩釋原位凝膠新劑型，其在牙周袋內(nèi)注入，接觸齦溝液后，溶劑擴(kuò)散并溶于水中，難溶的共聚物沉淀形成凝膠貯留于牙周袋內(nèi)并緩慢釋放藥物，達(dá)到局部治療牙周病的目的。后續(xù)將進(jìn)一步研究各處方成分的最適濃度；研究該原位凝膠的體外釋放模型；考察該原位凝膠制備工藝的穩(wěn)定性；以及進(jìn)一步研究HA的加入所帶來的優(yōu)勢(shì)。