蛇床子揮發(fā)油指標(biāo)成分含量測定的研究

張 迪 曹遠(yuǎn)東 鐘 慧 盧 興 黃 玲 王艷寧▲

1.南寧市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530022；2.四川九淵醫(yī)藥科技有限公司，四川 綿陽 621000

蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實(shí)，性溫、味苦，有小毒，具有燥濕祛風(fēng)、殺蟲止癢、溫腎壯陽的功效，可用于治療陰癢帶下、濕疹瘙癢、濕痹腰痛、腎虛陽痿和宮冷不孕[1]。在臨床上，多外用于治療各種皮膚病及滴蟲性陰道炎，手、足癬感染等疾病[2]，有抗癌、抗滴蟲、雌激素樣等藥理作用[3]。

關(guān)于蛇床子內(nèi)的活性物質(zhì)，國內(nèi)外已經(jīng)有了大量的研究，其主要成分有香豆素類、揮發(fā)油、色原酮及萜類等[4-8]。宋更申等[9]使用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法實(shí)現(xiàn)了同時測定蛇床子中7 種香豆素類活性成分；宋麗嬌等[10]建立了一種可以同時測定蛇床子中6 種香豆素成分的高效液相色譜（HPLC）法；早在1920 年前，日本人中尾萬三首先從中國東北產(chǎn)的蛇床子揮發(fā)油中分離出來左旋蒎烯與左旋莰烯；孟正木等[11]應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜-計算聯(lián)用技術(shù)從蛇床子揮發(fā)油中分離出66 個化學(xué)成分。對蛇床子揮發(fā)油中所含有的主要成分的研究及檢測分析方法已經(jīng)較為全面[12-14]，但對揮發(fā)油中具體成分的含量測定還未見報道。2015 年版《中華人民共和國藥典》[1]一部收載的中藥蛇床子，依然采用傳統(tǒng)的性狀和顯微鑒別來確定真?zhèn)?，含量測定也僅以測定蛇床子素這一種成分來控制質(zhì)量，具有片面性，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待完善和提高[15]。本研究提取了不同產(chǎn)地的5 種蛇床子中藥材中揮發(fā)油，經(jīng)GC-MS 分析后選出莰烯、β-蒎烯、乙酸龍腦酯作為共有指標(biāo)成分，建立一種同時測定3 種指標(biāo)成分具體含量的氣相色譜（GC）法，為進(jìn)一步完善中藥蛇床子質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

GC2MS/QP2010 氣 相 色 譜- 質(zhì) 譜 儀（日 本 島津公司）；GC9720 氣相色譜儀（中國福立儀器有限公司） ；BT25S 電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）；HS3120 超聲清洗儀，（北京恒奧德科技有限公司）。

5 種中藥材蛇床子購自廣西、安徽、河北正定、浙江、河北安國,經(jīng)鑒定為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實(shí)；莰烯對照品，純度＞99%，批號L1614003，上海阿拉丁試劑有限公司；β-蒎烯對照品，純度＞99%，批號A1720070，上海阿拉丁試劑有限公司；乙酸龍腦酯對照品，純度＞98%，批號20161114，寶雞晨光生物科技有限公司；無水甲醇（分析級），江蘇強(qiáng)盛能化學(xué)股份有限公司；無水硫酸鈉（分析級），天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取[16]

分別稱取不同產(chǎn)地干燥的蛇床子中藥材各200 g 于2 L 圓底蒸餾燒瓶中，加入純化水1200 ml，安裝揮發(fā)油提取器裝置，用常規(guī)水蒸氣蒸餾法加熱蒸餾，蒸餾至待蒸出的揮發(fā)油成分不再增加時，停止加熱。流出液分別以無水硫酸鈉脫水，得到淡黃色透明的揮發(fā)油液體，結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地蛇床子揮發(fā)油提取結(jié)果

2.2 GC-MS分析

2.2.1 GC-MS 條件[17]柱溫：程序升溫，起始溫度50 ℃，以3 ℃/min 的速率升溫至120 ℃，以5 ℃/min 的速率升溫至200 ℃；分流比：10 ∶1；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；柱流量：1.5 ml/min；進(jìn)樣隔墊吹掃流量；離子源：EI；檢測口溫度：260 ℃；采集延時：3 min；色譜柱為：DB-5。

2.2.2 GC-MS 分析 分別用移液槍吸取5 種蛇床子揮發(fā)油50 μl，用無水甲醇稀釋100 倍后，進(jìn)樣0.2 μl。結(jié)果共有19 種含量大于1% 不同成分析出揮發(fā)油成分均列出，不同產(chǎn)地的5 種蛇床子揮發(fā)油所含成分不盡相同，河北產(chǎn)蛇床子揮發(fā)油所含成分種類最多，經(jīng)比較選出79-92-5 莰 烯，18172-67-3 β- 蒎 烯，76-49-3乙酸龍腦酯等共有成分進(jìn)行含量測定。見圖1、表2。

表2 蛇床子揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果

圖1 廣西（A）、安徽（B）、河北正定（C）、浙江（D）和河北安國（E）產(chǎn)蛇床子揮發(fā)油GC-MS 圖

2.3 含量測定

2.3.1 混合對照品儲備液的配制 精密稱定一定質(zhì)量的莰烯、β-蒎烯、乙酸龍腦酯對照品，置于10 ml容量瓶中，用無水甲醇溶解、稀釋、定容，制成混合對照品儲備液，其中莰烯的濃度為1.342 mg/ml、β-蒎烯的濃度為0.273 mg/ml、乙酸龍腦酯的濃度為1.488 mg/ml，備用。

2.3.2 供試品溶液的配制 精密稱量不同產(chǎn)地的5 種蛇床子中提取的揮發(fā)油約52 mg，置于5 ml 容量瓶中，用無水甲醇溶解、稀釋、定容后，再精密量取定容好的蛇床子揮發(fā)油溶液2 ml 于5 ml 容量瓶中，用甲醇稀釋到相應(yīng)刻度作為供試品溶液。

2.3.3 氣相色譜條件 DB-5 毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID 檢測器，載氣為N2（99.999%），N2流速30 ml/min，H2流速30 ml/min，空氣300 ml/min，進(jìn)樣量1.0 μl，分流比10 ∶1，柱溫為程序升溫，起始溫度50℃，以3℃/min 的速率升溫至80℃，以10℃/min 的速率升溫至200℃；進(jìn)樣口溫度260℃，檢測口溫度260℃。

2.3.4 方法學(xué)考察 專屬性實(shí)驗(yàn)：分別吸取供試品溶液、對照品溶液與溶劑各1.0 μl，進(jìn)樣，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，表明甲醇色譜圖中在與樣品對照品相應(yīng)保留時間處未出色譜峰，空白溶液對樣品測定無干擾，方法的專屬性良好。

圖2 甲醇溶劑（A）、混合對照品溶液（B）和揮發(fā)油供試品溶液（C）的氣相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別量取制備的混合對照品溶液2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 ml，置于2 ml 容量瓶中，用甲醇溶液溶解、稀釋、定容，即得一系列濃度的混合對照品溶液，分別吸取1.0 μl 進(jìn)樣，測定峰面積。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸得出線性方程與回歸系數(shù)并算出線性范圍。線性關(guān)系考察結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度實(shí)驗(yàn)：吸取莰烯、β-蒎烯、乙酸龍腦酯混合對照品溶液1.0 μl，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定三種指標(biāo)成分的峰面積，計算RSD 值。莰烯、β-蒎烯、乙酸龍腦酯對照品混合經(jīng)GC 測定后，精密度結(jié)果見表4，結(jié)果表明，儀器精密度較好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取適宜濃度的蛇床子揮發(fā)油樣品溶液6 份，按2.3.2 項(xiàng)的方法制備供試品溶液，吸取1.0 μl 進(jìn)樣，測定峰面積，計算各成分濃度的平均值和RSD 值。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表4，莰烯、β-蒎烯、乙酸龍腦酯的RSD 值分別為：2.41%、2.45%、3.73%，表明方法的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密量取同一蛇床子揮發(fā)油樣品溶液，分別于0、2、4、6、 8、10、24 h，吸取1.0 μl 進(jìn)樣，測定三種指標(biāo)成分的峰面積，計算RSD 值。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4，表明供試品溶液中三種指標(biāo)成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表4 蛇床子揮發(fā)油中三種指標(biāo)成分的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率實(shí)驗(yàn)：吸取已知三種指標(biāo)成分含量的蛇床子供試品溶液1.0 ml 6 份置于2 ml 容量瓶中，分別準(zhǔn)確加入已知濃度的莰烯、β-蒎烯、乙酸龍腦酯混合對照品溶液1.0 ml，同樣方法制備成供試品溶液，精密吸取1.0 μl 進(jìn)樣，測定峰面積，計算加樣回收率，平均回收率和RSD 值。加樣回收測定結(jié)果見表5。

表5 加樣回收測定結(jié)果（n=6）

樣品含量的測定：分別取5 種蛇床子揮發(fā)油約52.0 mg，精密稱定，按2.3.2 項(xiàng)的方法制備供試品溶液，吸取1.0 μl 進(jìn)樣，進(jìn)行氣相色譜分析，測定三種指標(biāo)成分的峰面積，用外標(biāo)法測定莰烯、β-蒎烯、乙酸龍腦酯的含量（表6）。不同產(chǎn)地的蛇床子揮發(fā)油中含量有所不同：浙江產(chǎn)的蛇床子的含油率很高，但是指標(biāo)物質(zhì)的含量較低。河北產(chǎn)的2 種蛇床子得油率最低，但是指標(biāo)物質(zhì)的含量最高，其中河北安國的莰烯、β-蒎烯、乙酸龍腦酯的含量最高，故初步認(rèn)定河北產(chǎn)的蛇床子藥材質(zhì)量較好，但同一省份不同產(chǎn)地蛇床子質(zhì)量也存在一定差異。

表6 5種蛇床子揮發(fā)油中三種指標(biāo)物質(zhì)的含量測定結(jié)果（mg/g）

3 結(jié)論

蛇床子在真菌感染及腫瘤細(xì)胞抑制方面的有良好的功效，經(jīng)常用于各種濕疹等皮膚疾病，在各級醫(yī)院中使用量較大，具有較好的應(yīng)用前景[18-19]，因此對蛇床子藥材的質(zhì)量控制顯得尤為重要，其中揮發(fā)油的質(zhì)量可作為蛇床子中藥材質(zhì)量的評價指標(biāo)之一[20]。本研究建立了同時測定蛇床子揮發(fā)油中莰烯、β-蒎烯、乙酸龍腦酯三種活性成分含量的GC法。結(jié)果表明，建立的分析方法簡便、快速，增加了蛇床子臨床療效的質(zhì)量控制指標(biāo)，為完善現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)的提供依據(jù)。