應(yīng)用MHC肽四聚體技術(shù)檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者CCP抗原特異性T細(xì)胞及初步臨床應(yīng)用

房國祥 虞 偉

1.江蘇省常州市德安醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 常州 213000；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210000

自身免疫性疾病是指機(jī)體對(duì)自身抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病，其中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）在臨床較為常見[1]，其發(fā)病可能與遺傳、感染和激素等相關(guān)，以滑膜病變和關(guān)節(jié)改變?yōu)橹匾卣?，?xì)胞與體液免疫在RA 的病變發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[2-3]。目前，對(duì)于環(huán)瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）在RA 的發(fā)病中的作用研究較多，可證實(shí)RA 的病變嚴(yán)重程度與抗CCP 抗體水平有著緊密聯(lián)系[4-5]，而對(duì)于RA 患者的抗原肽的細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)研究尚不充分。

MHC 肽多聚體檢測技術(shù)目前已廣泛用于多種腫瘤、結(jié)核和疫苗的療效監(jiān)測等方面[6-7]。本研究基于流式細(xì)胞儀（FCM）結(jié)合肽四聚體技術(shù)的良好性能，檢測了54 例臨床病例的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中CD4+CD8-tetramer-CCP陽性細(xì)胞和作為對(duì)照的CD4+CD8- 人中間葉促皮質(zhì)樣肽（hCLIP）-tetramer 細(xì)胞，將攜帶無關(guān)肽的四聚體作為非特異性對(duì)照，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MHC 肽四聚體技術(shù)有一定比例的非特異性結(jié)合，為消除此影響，故以兩者的差值定義為CCP抗原特異性T 細(xì)胞（CCP/AST）。分別檢測RA患者與自身免疫性疾病對(duì)照組患者的CCP/AST比率，以及RA 患者中抗CCP 抗體陰、陽性患者中的比率，研究RA 患者的臨床表現(xiàn)與檢測結(jié)果有無聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2018 年4—11 月住院及門診的確診患者，包括：RA 組35 例；疾病對(duì)照組19 例，分別為系統(tǒng)性紅斑狼瘡12 例，強(qiáng)直性脊柱炎3例，Still病1例，貝赫切特病2 例，肌炎1 例。本研究中自身免疫性疾病均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987 年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。選取健康對(duì)照組30 名。所有患者和健康對(duì)照組均知情同意參與本研究。本研究獲東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。三組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），具有可比性。見表1。

表1 三組性別與年齡比較

1.2 試劑材料

CCP 的 純 度＞95%，Gibco 公 司 提 供 的RPMI 1640 培養(yǎng)液；eBioscience 公司提供的硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記抗CD4 單抗，酶聯(lián)APC 的鼠抗IgG-b 同型對(duì)照；BD 公司提供的APC 鼠抗人CD44 單克隆抗體；Invitrogen 公司提供的Cy 5.5-PE 抗人CD8 單克隆抗體；深圳聯(lián)科提供的碘化丙啶（PI）染色液；挪威Axis-shield 提供的淋巴細(xì)胞分離液；實(shí)驗(yàn)肽為標(biāo)記藻紅蛋白（PE）的MHC-DRB1*0401/CCP/tetramer，對(duì)照肽為標(biāo)記PE 的MHC-DRB1*0401/hCLIP/tetramer，由美國國立衛(wèi)生研究院構(gòu)建提供。

1.3 分離PBMC

采集6 ～9 ml 靜脈血以肝素抗凝，以密度梯度離心法分離PBMC，使用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為106～107/ml。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)的準(zhǔn)備

在兩支檢測管中分別加入1 μl PE 標(biāo)記的hCLIP-tetramer 及1μl PE 標(biāo) 記 的CCP-tetramer，再分別加入PBMC 200 μl（濃度為106～107/ml）?；靹蚝?，37℃下避光孵育30 min。用PBS 重懸，以1400 r/min 離心洗滌6 min，棄去上清，以100 μl PBS 重懸沉淀。分別加入15 μl 抗人CD4 單克隆抗體，2.5 μl 的Cy 5.5-PE 標(biāo)記抗人CD8 單克隆抗體，10 μl 的APC 鼠抗CD44 單克隆抗體?；靹蚝?0℃下避光孵育30 min，再次洗滌。棄上清，以500 μl PBS 重懸沉淀，加入2 μl 的PI 后檢測。

收集并凍存研究對(duì)象的血清樣本，并應(yīng)用生物素-鏈霉親合素放大ELISA 系統(tǒng)[9]測量標(biāo)本的抗體水平，記錄其吸光度（A）結(jié)果，并以此將患者分為抗CCP 抗體陽性與陰性兩組。

1.5 檢測抗體

1.6 調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀檢測CCP/AST

校準(zhǔn)BD 公司的流式細(xì)胞儀FACS Calibur后，以隨機(jī)軟件分析數(shù)據(jù)，將流式細(xì)胞儀的側(cè)散射（SSC）和前散射（FSC）設(shè)置為線性增大，設(shè)置熒光信號(hào)為對(duì)數(shù)放大，以淋巴細(xì)胞設(shè)門，計(jì)數(shù)60 000 個(gè)淋巴細(xì)胞，特異性CCP/AST 為CD4+CD8-tetramer-CCP陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)并記錄。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗(yàn)，使用單因素方差分析比較三組計(jì)量資料。制作ROC 曲線，選擇用于RA 診斷的最佳界限值，計(jì)算曲線下面積（AUCROC）。以P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組CCP/AST檢測結(jié)果

RA 組患者的CD4+CD8-tetramer-CCP 陽性細(xì)胞比率（即實(shí)驗(yàn)肽/AST 細(xì)胞數(shù)）、CD4+CD8-tetramer-CCP 陽性細(xì)胞比率與CD4+CD8-tetramer-hCLIP 陽性細(xì)胞比率（即對(duì)照肽/AST 細(xì)胞數(shù)）的差值（即CCP/AST）均高于疾病對(duì)照組、健康對(duì)照組（P＜ 0.05），見表2。RA 組中，抗CCP 抗體陽性組的CD4+CD8-tetramer-CCP 陽性細(xì)胞比率、CCP/AST 均高于抗CCP抗體陰性組，（P＜ 0.05），見表3。

表2 三組外周血CCP/AST的檢測結(jié)果（%，x ± s）

表3 RA組外周血CCP/AST的檢測結(jié)果（%，x ± s）

2.2 ROC曲線分析

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)方法檢測的CCP/AST 比率用于RA 診 斷 時(shí)AUCROC為0.823，95% 可 信 區(qū) 間 為0.695 ～0.954（圖1）。CCP/AST 比 率 為0.63% 時(shí)用于RA 診斷的敏感度為0.788，特異性0.882，達(dá)到最高的診斷效能。

圖1 CCP/AST 比率用于診斷RA 的ROC 曲線

2.3 RA患者CCP/AST檢出結(jié)果與臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

依據(jù)CCP/AST 的細(xì)胞比率是否大于0.63%而將RA 患者分為CCP/AST 細(xì)胞升高與非升高兩組。兩組的腫痛關(guān)節(jié)數(shù)、破壞關(guān)節(jié)數(shù)、血沉及C 反應(yīng)蛋白（CRP）的數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），CCP/AST升高組的類風(fēng)濕因子（RF）高于CCP/AST 非升高組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表4。

表4 兩組RA患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及臨床表現(xiàn)比較（x ± s）

3 討論

抗原特異性 T 淋巴細(xì)胞（AST）在免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞[10]，以往對(duì)AST 的檢測操作繁瑣且準(zhǔn)確度不高。Altman 等[11]依據(jù)MHC 與T 細(xì)胞受體（TCR）特異性結(jié)合的原理，于1996 年首先創(chuàng)立MHC 四聚體技術(shù)，近年來，該技術(shù)已在針對(duì)AST 的研究領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用[12-13]。MHC 可將抗原肽遞呈到細(xì)胞表面，而被TCR 識(shí)別并結(jié)合，這種識(shí)別和結(jié)合，在RA 等疾病的發(fā)病中起了重要作用，研究特定疾病的AST 對(duì)于理解疾病的發(fā)展和研究新的治療策略具有重要意義[14]。MHC肽四聚體技術(shù)可有效提高TCR 和抗原肽的親合力，顯著增強(qiáng)抗原肽與T 細(xì)胞結(jié)合的穩(wěn)定性，與熒光染料分子的結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)了染色效果，利于流式細(xì)胞儀的檢測。其具有特異性強(qiáng)、敏感度高、無須無菌操作、無需體外擴(kuò)增、對(duì)細(xì)胞損傷小等諸多優(yōu)點(diǎn)[15]。不僅能定量檢測AST，一定條件下，還可使用流式細(xì)胞儀直接對(duì)AST 進(jìn)行分選以利于進(jìn)一步的功能研究。但MHC 肽四聚體技術(shù)的運(yùn)用須優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，從而提高獲取可靠實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性。

本研究以流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合MHC 肽四聚體技術(shù)檢測CCP/AST，發(fā)現(xiàn)RA 組檢出的細(xì)胞比率結(jié)果較疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組均顯著增高（P＜ 0.05），且RA 患者中抗CCP 抗體陰性者的外周血CCP/AST細(xì)胞比率結(jié)果顯著低于抗CCP 抗體陽性者（P＜ 0.05）。提示RA 患者的AST 對(duì)CCP 抗原肽的親和力明顯高于其他自身免疫疾病患者，RA 患者的AST 對(duì)CCP 抗原肽的反應(yīng)性增加，提示CCP/AST 可能在RA 的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，T 細(xì)胞受體與抗原遞呈細(xì)胞表面的MHC 抗原肽的親和力高低是影響機(jī)體細(xì)胞免疫的重要因素，RA 患者高比率的CCP/AST 檢出提示患者體內(nèi)存在針對(duì)瓜氨酸化蛋白的特異性細(xì)胞免疫的發(fā)生，持續(xù)的細(xì)胞免疫存在可能是導(dǎo)致疾病的遷延進(jìn)展的重要因素。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合MHC 肽四聚體技術(shù)檢測CCP/AST細(xì)胞的比率用于診斷RA 時(shí)的AUCROC為0.823，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。CCP/AST 升高組的RA 患者的高水平RF 提示此類患者有較高的體液免疫反應(yīng)存在。同時(shí)，部分RF 檢測為陰性的RA 患者存在較高的CCP/AST 的檢出水平，從而提示本方法可用于RF 陰性的臨床疑似患者的篩查，為臨床診療提供較為明確的診斷依據(jù)。

綜上，本研究所述的標(biāo)記和檢測CCP/AST 細(xì)胞的方法結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性較好，可作為RA 的潛在診斷用指標(biāo)，與抗CCP 抗體等傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)聯(lián)用可以有效提高RA 的診斷水平。