術連飲對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腦腸肽的影響

劉蔚雯 張學強 戴燕真 黃 群▲

1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.國藥集團汕頭金石制藥有限公司，廣東 汕頭 363509

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種腸道功能紊亂疾病，表現(xiàn)為反復發(fā)作的腹痛、腹瀉，伴有排便頻率改變和大便性狀異常[1]。根據(jù)羅馬Ⅳ標準[2]分為4 種亞型：腹瀉型、便秘型、混合型和不定型，在我國以腹瀉型腸易激綜合征（diarrheal irritable bowel syndrome，IBS-D）最為多見。該病慢性進展，持續(xù)或間歇發(fā)作，給患者日常生活和心理健康帶來極大困擾?，F(xiàn)有治療手段局限于改善癥狀，緩解病情，卻難以根治。IBS-D 在祖國醫(yī)學中屬于“泄瀉”“腹痛”等范疇，臨床辨證分型為脾虛濕盛型、肝郁脾虛型、脾腎陽虛型、脾胃濕熱型等[3]，IBS-D 患者脾虛濕盛型比例高達40%[4]，提示健脾燥濕止瀉法在治療中具有積極意義。前期研究表明[5]，以健脾燥濕法為指導組成的術連飲方，能夠改善功能性消化不良大鼠腸運動障礙。本研究通過觀察術連飲對IBS-D 大鼠體重、進食量、Bristol 評分、P 物質（substance P，SP）、神經(jīng)肽Y（neuropeptide，NPY）的影響，探討術連飲調節(jié)腦腸肽的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體重（210±20）g，由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（閩）2016-0002。實驗過程遵守《關于善待實驗動物指導性意見》的原則和要求[6]。根據(jù)體重均衡原則，按照隨機數(shù)表法分為空白組、模型組、匹維溴銨組和術連飲組，每組各10 只。

1.2 藥品與試劑

番瀉葉（江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號：1908006），術連飲，即生白術與黃連（黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號：D9080101），匹維溴銨片（法國Abbott Laboratories Limited，批號：708624）。SP 抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：DF6541），NPY 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：PB9296）。

1.3 實驗儀器

7300 熒 光 定 量PCR 儀（美 國ABI 公 司），Tamon-5200 超高靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司）。

1.4 造模與模型評價

番瀉葉灌胃結合束縛法復制IBS-D 模型大鼠[7]：空白組灌胃20 ml/kg 生理鹽水，不做束縛刺激，其余大鼠均灌胃番瀉葉水煎液20 ml/kg，2 次/d，灌服1 h 后，用軟毛發(fā)圈束縛大鼠前肢，并將透明膠帶纏繞其肩部與胸部，束縛1 h，連續(xù)14 d。

造模后大鼠體形消瘦，束縛時暴躁，易激惹，解除束縛后精神萎靡，喜扎堆倦臥懶動，大便稀溏，肛周及尾部沾染稀便，污濁臭穢。模型組大鼠體重、進食量均減少，Bristol 評分升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），表明模型復制成功。造模過程中無大鼠死亡。

1.5 給藥方法

造模成功后于第15 天開始給藥，除空白組外，其余各組繼續(xù)灌服番瀉葉煎液20 ml/kg，1 h后灌胃給藥，空白組與模型組均灌胃等體積生理鹽水，匹維溴銨組生藥18.5 mg/kg，術連飲組生藥4.6 g/kg。給藥1 h 后，束縛1 h，1 次/d，連續(xù)14 d。

1.6 樣本采集

于實驗第28 天，禁食（不禁水、藥）24 h，第29 天以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹腔采血后，快速斷頭取腦，在冰臺上分離下丘腦，截取距離大鼠肛緣約6 cm處結腸樣本，置于-80℃冰箱保存待測。

1.7 觀察指標及評價標準

體重的測定：每周固定時間對各組大鼠稱重，觀察體重的變化。

進食量的測定：測定各組單只大鼠日平均進食量。每天固定時間添加定量飼料（500 g），24 h 后稱取剩余飼料重量。日平均進食量（g）=（加料量-剩余量）/每組大鼠只數(shù)。

Bristol 評分：分別于造模前（第1 天）、給藥前（第14 天）、給藥后（第28 天）進行評分，大鼠分籠單只飼養(yǎng)，自由進食與飲水，收集2 h 內糞便，根據(jù)Bristol 分級評分標準[8]進行評分。見表1。

表1 Bristol分級及評分

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測SP、NPY mRNA 表達：稱取下丘腦和結腸組織各50 mg，充分研磨，用Trizol 試劑提取總RNA，取1 μg的RNA 逆轉錄合成cDNA，將cDNA 產(chǎn)物配置qPCR 反應體系，引物序列由福州鉑尚生物有限公司合成。見表2。

表2 引物序列

Western blot 法檢測SP、NPY 蛋白表達：采用預冷RIPA 蛋白抽提試劑提取蛋白，按0.1 g 組織加入1 ml 含PMSF 的RIPA 裂解液，充分勻漿，冰浴30 min，4℃離心，12 000 rpm，5 min，吸取上清液，移至預冷離心管中。加入BSA 標準液，檢測樣品蛋白含量，按1 ∶4 比例加入5×SDS-PAGE loading buffer，水浴加熱5 min，以充分變性蛋白。以RIPA調整蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量，配制5%濃縮膠，電泳，轉膜，封閉，一抗、二抗孵育，曝光顯影，化學發(fā)光成像系統(tǒng)分析。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，行t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，使用秩和檢驗，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠體重變化比較

造模前各組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。造模14 d 后（給藥前），模型組、匹維溴銨組、術連飲組大鼠體重均低于空白組（P＜ 0.01）；治療14 d 后（給藥后），匹維溴銨組、術連飲組大鼠體重均高于模型組（P＜ 0.01）。見表3。

表3 四組大鼠體重變化比較（g，x ± s）

2.2 四組大鼠日平均進食量比較

造模前各組大鼠進食量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。造模期（14 d）模型組、匹維溴銨組、術連飲組大鼠進食量均低于空白組（P＜ 0.01）；治療期（14 d）匹維溴銨組、術連飲組大鼠進食量均高于模型組（P＜ 0.01）。見表4。

表4 四組大鼠日平均進食量比較（g，x ± s）

2.3 四組大鼠Bristol評分比較

造模前各組大鼠Bristol 評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。給藥前模型組、匹維溴銨組、術連飲組大鼠Bristol 評分均高于空白組（P＜ 0.01）；給藥后匹維溴銨組、術連飲組大鼠Bristol 評分均低于模型組（P＜ 0.05）。見表5。

表5 四組大鼠Bristol評分比較（分，x ± s）

2.4 四組大鼠下丘腦和結腸組織SP、NPYmRNA表達比較

模型組大鼠下丘腦及結腸SP mRNA 表達高于空白組，NPY mRNA 表達低于空白組（P＜ 0.01）。匹維溴銨組、術連飲組大鼠SP mRNA 表達均低于模型組，NPY mRNA 表達均高于模型組（P＜ 0.01）。見表6。

表6 四組大鼠下丘腦和結腸組織SP、NPY mRNA表達比較（x ± s）

2.5 四組大鼠下丘腦和結腸組織SP、NPY蛋白表達比較

模型組大鼠下丘腦及結腸SP 蛋白表達高于空白組，NPY 蛋白表達低于空白組（P＜ 0.01）。匹維溴銨組、術連飲組SP 蛋白表達均低于模型組，NPY蛋白表達均高于模型組（P＜ 0.01）。見圖1、表7。

表7 四組大鼠下丘腦和結腸組織SP、NPY蛋白表達比較（x ± s）

圖1 大鼠下丘腦和結腸組織SP、NPY 蛋白電泳圖

3 討論

隨著神經(jīng)胃腸病學研究的深入，腦-腸互動異常與IBS 發(fā)病的相關性日益受到重視。研究表明[9]，IBS 患者給予直腸擴張后，其大腦邊緣系統(tǒng)明顯活躍，而邊緣系統(tǒng)主要負責處理疼痛應激與情緒反應等。由此可見，持續(xù)的腸道刺激可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）異常反饋，出現(xiàn)腦-腸互動異常，而腦腸肽作為腦-腸互動的中介，發(fā)揮著重要的作用。腦腸肽是一種小分子多肽，在CNS、腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）及胃腸道均有分布，既可作為神經(jīng)遞質傳遞信息，亦可作為激素發(fā)揮雙重作用，與IBS 發(fā)病相關的腦腸肽主要有SP、NPY 等。SP 是一種興奮性腦腸肽，廣泛分布于CNS 與ENS 中，許向前[10]實驗發(fā)現(xiàn)，IBS-D 模型大鼠的十二指腸及下丘腦組織中SP 含量明顯升高，SP 的升高能夠促進結腸運動，刺激腸黏膜分泌水和電解質，從而引起腹瀉。NPY 是一種抑制性腦腸肽，主要存在于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)及腎上腺髓質的嗜鉻細胞中，在腸神經(jīng)叢可與周圍性乙酰膽堿轉移酶相結合，抑制胃腸運動和水、電解質的分泌等；在下丘腦和海馬，NPY 可發(fā)揮中樞拮抗應激與穩(wěn)定情緒等作用。研究顯示[11]，IBS 患者結腸及下丘腦組織中NPY 的含量低于正常人。馬軍等[12]研究表明，IBS-D 大鼠結腸組織NPY 蛋白表達顯著降低。本研究結果顯示，模型組大鼠下丘腦和結腸組織中SP 蛋白及其mRNA 表達升高，NPY 蛋白及其mRNA 表達降低，Bristol 評分明顯升高，大便稀軟或不成形。經(jīng)術連飲治療后，Bristol評分明顯降低，稀水便減少或成形。提示術連飲可能通過影響興奮性和抑制性腦腸肽的分泌，下調SP、上調NPY 表達，使腹瀉癥狀得以好轉，達到治療IBS-D 目的。關于SP 與NPY 之間的信號傳導通路研究，將在后續(xù)實驗中進行深入探討。

中醫(yī)學并無“腦腸互動”這一概念，但腦腸相通的整體觀早已貫穿于經(jīng)絡與藏象學說之中。腦為奇恒之腑，位居頭部，而頭為“諸陽之會”，例如足陽明胃經(jīng)與手陽明大腸經(jīng)于鼻旁相接，說明頭面（腦）與胃腸經(jīng)絡相連，存在著信息交互傳遞的通道?！夺t(yī)林改錯》曰[13]：“靈機記性在腦者，因飲食生氣血，長肌肉，精汁之清者，化而為髓，由脊髓上行入腦，名曰腦髓”，王清任明確指出腦主神明，為髓之海，其生理功能的正常發(fā)揮有賴于后天之精的充養(yǎng)，而后天之精主要來源于脾胃腸共同作用所化生之水谷精微。若脾失健運，氣血生化乏源，以致髓海不充，腦府失養(yǎng)，與腸腑之互動失衡；且脾虛易于生濕，濕郁化熱，下注大腸，腸腑傳化失司，升降失常，則見泄瀉。上述所論可知，脾虛與濕盛是IBS-D 病機的兩個主要方面，治當以健脾燥濕，清腸止利立法。術連飲由白術、黃連組方而成，《醫(yī)學衷中參西錄》曾謂[14]：“白術，性溫而燥，氣不香竄，味苦微甘微辛，善健脾胃，消痰水，止泄瀉”?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載黃連“主腸澼腹痛下痢”[15]，《本草正義》亦云：“黃連大苦大寒，苦燥濕，寒勝熱，能泄降一切有余之濕火”[16]。方中生白術、黃連之比為4 ∶1，重用白術為君，功擅健脾燥濕止瀉；輔以黃連，善清脾胃大腸濕熱，一則助君藥燥濕止痢；二則清濕郁所生之熱；三則苦寒以制白術之溫，而無助熱之虞，且黃連之降泄與白術之升清，可調氣機之升降，是臣藥而兼佐藥之能。合而用之，共成補清兼顧，升降同調之劑，使脾虛得健，濕去熱清，而泄利自止。