重組ProTα誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬的作用及機(jī)制

栗 華 高藝萍 陳 觀 吳 娜

1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建 廈門 361003；2.福建醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)部，福建 福州 350122

胸腺素原α（prothymosinα，ProTα）具有多種生理功能，如促進(jìn)白介素（interleukin，IL）-2、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的分泌；促進(jìn)IL-2 受體的表達(dá)，從而產(chǎn)生非特異性腫瘤殺傷作用；同時(shí)，可誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞（CD8+）和輔助性T 細(xì)胞（CD4+）的特異性抗腫瘤作用[1-2]。先前研究發(fā)現(xiàn)ProTα 抗腫瘤作用遠(yuǎn)強(qiáng)于胸腺素α1[3]；許多細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生，其中包括IFN-γ、TNF-α、IL-10 和IL-12等[4-5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，TACE 聯(lián)合胸腺素α1 可明顯增加中晚期原發(fā)性肝癌患者免疫細(xì)胞自噬水平[6]。推測(cè)ProTα 抗腫瘤作用除了可以調(diào)節(jié)免疫外，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡發(fā)揮抗腫瘤作用。為此，本研究觀察了ProTα 對(duì)HepG2 細(xì)胞和H22 肝癌荷瘤小鼠癌細(xì)胞自噬作用的影響，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究經(jīng)廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。ProTα（廈門大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院周克夫教授與廈門伯賽基因轉(zhuǎn)錄技術(shù)有限公司聯(lián)合制備，濃度：1.3 mg/ml ）；奧沙利鉑（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20093487，規(guī)格：50 mg/支）；HepG2 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）；抗p-mTOR；P62 一 抗（BD Biosciences 公 司）；抗β-actin 一 抗（美 國(guó)Sigma 公 司）；Human IFNgamma/γ-IFN Protein（北京義翹神州科技股份有限公司）；抗LC3B 抗體（ab63817，英國(guó)abcam 公司）；ZB-5305 辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 及ZB-5301 辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；CCK-8 試劑盒（Dojindo 日本同仁化學(xué)研究所）。

動(dòng)物與瘤株：腫瘤H22（小鼠肝癌）細(xì)胞株（廈門大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；昆明小鼠，S P F 級(jí)，4 周齡，體重20 ～25 g，雄性（廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 法測(cè)定ProTα、IFN-γ 作用后HepG2細(xì)胞的存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，以5.0×103個(gè)/ 孔的細(xì)胞密度接96 孔板中，培養(yǎng)24 h 待HepG2 細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（40、100、400 ng/ml） 的ProTα、IFN-γ（100 ng/ml）進(jìn)行藥物處理，24、48 h 后分別進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)。每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)孔同時(shí)設(shè)不加藥的對(duì)照組和只加培養(yǎng)液的空白組。檢測(cè)時(shí)加入CCK-8 溶液10 μl/ 孔細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度（D）值（重復(fù)3 次），并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（D 實(shí)驗(yàn)組值-D空白組值）/（D 對(duì)照組值-D 空白組值）×100%。

1.2.2 H22 荷瘤小鼠建立、分組及干預(yù) 抽取生長(zhǎng)于小鼠腹腔中的H22 腫瘤腹水，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后稀釋至1×107個(gè)/ml，將H22 肝癌腫瘤細(xì)胞接種于50 只雄性昆明小鼠右前肢外側(cè)，每只小鼠接種100 μl，即每只小鼠接種106個(gè)細(xì)胞，1 周后篩選出腫瘤直徑＞2 mm 的小鼠40 只，隨機(jī)數(shù)表法分為四組，每組各10 只，對(duì)照組、ProTα 組、奧沙利鉑組、ProTα+奧沙利鉑組，小劑量奧沙利鉑（2.5 mg/kg）腹腔注射2 周，隔日一次，共注射6 次，ProTα（40 ng/g）腹腔注射2 周，隔日一次，共7 次。利用苦味酸對(duì)小鼠進(jìn)行標(biāo)記，隔3 d 稱重一次，對(duì)照組給予等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中若有小鼠死亡，記錄其死亡時(shí)間并留存腫瘤標(biāo)本。

1.2.3 腫瘤質(zhì)量、抑瘤率、胸腺指數(shù)計(jì)算 給藥期間觀察小鼠生存情況，末次給藥后24 h 稱重，脫頸法處死所有小鼠，剝離瘤體，修剪雜質(zhì)后稱取瘤重，抑瘤率=（模型組瘤重-干預(yù)組瘤重）/模型組瘤重×100%；取胸腺稱重，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.2.4 Western blot 法檢測(cè)自噬相關(guān)LC3B、P62 及p-mTOR 蛋白表達(dá) 取腫瘤組織，液氮研磨后，TRIzol 法提取總蛋白。經(jīng)過(guò)上樣、SDS 電泳、轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉。分別加入稀釋后的兔抗鼠LC3B、P62、p-mTOR 單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。洗膜，加入1 ∶1000 的帶有熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h。洗膜，ECL 發(fā)光法顯色，以β-actin 作為內(nèi)參，采用GIS1000 分析軟件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

CCK-8 結(jié)果顯示，不同濃度（40、100 、400 ng/ml）的ProTα對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（濃度40 ng/ml：t=1.892，P＞ 0.05；濃度100 ng/ml：t=1.903，P＞ 0.05；濃度400 ng/ml：t=1.897，P＞ 0.05）。100 ng/ml IFN-γ 處理HepG2細(xì)胞24、48 h，HepG2 細(xì)胞的存活率分別降低61.03%、52.16%，與對(duì)照組比較，抑制作用明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24 h：t=6.861，P＜ 0.01；48 h：t=8.496，P＜ 0.01）。見圖1。同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B 蛋白水平顯著增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24 h 組：t=5.144，P＜ 0.01；48 h 組：t=6.322，P＜ 0.01），結(jié)果提示IFN-γ 可以誘導(dǎo)肝癌HepG2 細(xì)胞的自噬活性，見圖2。

圖1 給予100 ng/ml IFN-γ 24、48 h 后肝癌HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2 小鼠一般情況

隨移植瘤的生長(zhǎng)，各組小鼠的活動(dòng)均減少，攻擊性降低，精神萎靡，進(jìn)食、飲水減少，毛發(fā)無(wú)光澤易脫落，奧沙利鉑組小鼠表現(xiàn)最明顯。

2.3 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、抑瘤率及胸腺指數(shù)比較

與對(duì)照組比較，各干預(yù)組腫瘤質(zhì)量較?。≒＜ 0.05）；ProTα 可明顯降低H22 實(shí)體瘤小鼠的腫瘤質(zhì)量（t=3.006，P＜ 0.05），抑瘤率達(dá)34.7%；ProTα+奧沙利鉑組抑瘤率高于ProTα 組（t=3.504，P=0.003），但與奧沙利鉑組比較，抑瘤率雖有提高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.695，P=0.107）；與對(duì)照組及奧沙利鉑組比較，ProTα 和ProTα+奧沙利鉑組胸腺指數(shù)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、抑瘤率、胸腺指數(shù)比較（x ± s）

2.4 各組H22荷瘤小鼠瘤組織中自噬調(diào)控蛋白LC3B、P62及p-mTOR蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，ProTα 組、奧沙利鉑組和ProTα+奧沙利鉑組小鼠瘤組織中LC3B 蛋白表達(dá)均升高（P＜ 0.05），ProTα 組、奧沙利鉑組和ProTα+奧沙利鉑組小鼠瘤組織中P62 及p-mTOR表達(dá)均明顯下降（P＜ 0.05），尤其是ProTα+奧沙利鉑組下降更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表 2、圖 2 ～ 3。

表2 各組H22荷瘤小鼠瘤組織中LC3B、P62及p-mTOR蛋白表達(dá)量比較（x ± s）

圖2 各組LC3B、P62 蛋白表達(dá)Western blot 電泳

圖3 各組p-mTOR 蛋白表達(dá)Western blot 電泳

3 討論

奧沙利鉑是晚期胃腸腫瘤治療的新一代細(xì)胞毒藥物。研究表明，含奧沙利鉑的TACE 治療方案可明顯延長(zhǎng)晚期肝癌患者生存時(shí)間。但常規(guī)劑量奧沙利鉑也容易引起骨髓抑制及腎功能損害。因此，尋找有效的聯(lián)用藥物，降低不良反應(yīng)、提高奧沙利鉑臨床利用率及療效非常重要。

自噬與凋亡是細(xì)胞程序性死亡的兩種不同類型，兩者共同維持生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生存和死亡也有非常重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，很多分子或蛋白是通過(guò)調(diào)節(jié)自噬抑制腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)展[7]。當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LC3A 向LC3B轉(zhuǎn)化明顯增加。LC3 是自噬過(guò)程的標(biāo)記蛋白之一，參與自噬全過(guò)程，在自噬體形成過(guò)程中，位于自噬體內(nèi)的胞漿型LC3，即LC3A 與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)換成膜型LC3B，并由自噬體膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到膜上。因此，LC3B 與自噬體的數(shù)量更加密切。因此利用Western blot 檢測(cè)LC3B 蛋白的水平，可反映細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量的變化[8]。p62 是自噬的選擇性作用靶點(diǎn)，p62 蛋白表達(dá)水平可以反映自噬降解能力[9]，即自噬活性增高可導(dǎo)致p62 減少。近年來(lái)常將其作為自噬活性檢測(cè)指標(biāo)。此外，許多細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生，其中包括IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-12 等[10-12]。ProTα 可 促 進(jìn)IL-2、IFN-γ、MIF 的分泌，產(chǎn)生非特異性腫瘤殺傷作用[4-5]。同時(shí)，ProTα 可誘導(dǎo)腫瘤特異性CD8+和CD4+特異性抗腫瘤作用；并發(fā)現(xiàn)ProTα 的抗腫瘤作用遠(yuǎn)強(qiáng)于胸腺素α1[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)[14]，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組ProTα 通過(guò)下調(diào)Treg 細(xì)胞、上調(diào)NKG2D 陽(yáng)性細(xì)胞比例發(fā)揮顯著的抑瘤效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，各種濃度的ProTα 對(duì)HepG2 細(xì)胞無(wú)直接抑制作用，然而，與對(duì)照組比較，IFN-γ 抑制HepG2 細(xì)胞增殖作用明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B 蛋白水平顯著增加（P＜ 0.05），提示IFN-γ 可以抑制HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)肝癌HepG2 細(xì)胞的自噬活性。而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究也表明，ProTα 可明顯提高胸腺指數(shù)，降低H22 實(shí)體瘤小鼠的瘤質(zhì)量系數(shù)，抑瘤率達(dá)34.7%，進(jìn)一步證實(shí)ProTα 具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用。本研究結(jié)果說(shuō)明ProTα 抑瘤作用非直接抑制H22 腫瘤細(xì)胞增殖，而是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。同時(shí)本研究表明，重組ProTα 可顯著上調(diào)瘤組織中自噬相關(guān)LC3B 蛋白的表達(dá)，下調(diào)P62 及p-mTOR 蛋白的表達(dá)。以上研究結(jié)果表明，ProTα可以通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用抑制H22 荷瘤小鼠腫瘤組織生長(zhǎng)，并可能通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 誘導(dǎo)H22 荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞自噬抑制腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)ProTα 在體內(nèi)聯(lián)合奧沙利鉑與單獨(dú)使用ProTα 或奧沙利鉑相比，對(duì)H22 具有更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，提示聯(lián)合用藥組顯示出了更明顯的優(yōu)勢(shì)。mTOR 是細(xì)胞自噬的負(fù)性調(diào)控因子，可抑制自噬的發(fā)生。有研究表明，抑制p-mTOR 可促進(jìn)HeLa 細(xì)胞、肝癌細(xì)胞HepG2等自噬[15]，Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，ProTα 在體內(nèi)聯(lián)合奧沙利鉑或單獨(dú)使用ProTα 可上調(diào)LC3B 及下調(diào)P62 及p-mTOR 蛋白表達(dá)。說(shuō)明ProTα 聯(lián)合奧沙利鉑給藥可能是通過(guò)誘導(dǎo)肝癌自噬抑制腫瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)。

綜上所述，ProTα 作為一種免疫調(diào)節(jié)藥物，可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞釋放IFN-γ 等細(xì)胞因子下調(diào)p-mTOR 表達(dá)誘導(dǎo)自噬發(fā)揮抗腫瘤作用；ProTα 可提高奧沙利鉑的抗癌療效，為ProTα 進(jìn)一步開展臨床研究和開發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)。