農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展

李穎 鞠斯羽 魏健

(長(zhǎng)春師范大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130051)

大豆是世界上最主要的油料作物之一，同時(shí)也是主要的食品和飼料中的蛋白質(zhì)原料。大豆種子中，不但富含一定量的人體必需氨基酸，還具有豐富的膳食礦物質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸和異黃酮等對(duì)人類(lèi)身體發(fā)育有利的物質(zhì)。世界上栽培規(guī)模最大的轉(zhuǎn)基因作物就是轉(zhuǎn)基因大豆，在當(dāng)時(shí)也是第一批進(jìn)入商業(yè)栽培市場(chǎng)的轉(zhuǎn)基因作物之一?？茖W(xué)研究已經(jīng)證明，有著巨大使用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因作物新品種必須在成百上千乃至幾萬(wàn)次的轉(zhuǎn)化事件中選出[1]。

雖然大豆基因組序列已經(jīng)被公布[2]，但大多數(shù)大豆基因的功能尚不清楚。所以，一個(gè)最有效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方式就是研究大豆基因功能、通過(guò)分子育種培育大豆新品種的重要前提。大約85%的轉(zhuǎn)基因植物都是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化途徑而成功得到的。農(nóng)桿菌是一類(lèi)革蘭氏陰性菌，包含了根癌農(nóng)球菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，兩者各自包含了功能構(gòu)造相同的Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA。當(dāng)植被受傷時(shí)，農(nóng)桿菌可以通過(guò)侵染植被傷口進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)將其T-DNA嵌入在植株基因組中，使得其所攜帶的基因可以直接在植株上表現(xiàn)。而受損植株根系中可以產(chǎn)生羥乙酰丁香酸和乙酰丁香酸，作為標(biāo)志物質(zhì)可以引導(dǎo)Ti質(zhì)粒的VIR基因和根瘤菌染色體操縱子的表現(xiàn)。Vir基因產(chǎn)物可以使Ti質(zhì)粒上的t-DNA序列融合在宿主細(xì)菌的基因組上，從而能夠通過(guò)減數(shù)分裂安全的遺傳到下一代。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法有很多優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性高、實(shí)驗(yàn)成本低等，因此是植物轉(zhuǎn)化的最佳選擇之一。然而，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法仍然存在諸多問(wèn)題：其轉(zhuǎn)化效率低、受多種因素影響等，這些問(wèn)題限制了遺傳轉(zhuǎn)化效率。本文總結(jié)了影響大豆遺傳轉(zhuǎn)化的各種因素，為大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的調(diào)整及有關(guān)科學(xué)研究提供依據(jù)。

1 農(nóng)桿菌侵染液濃度對(duì)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌侵染液的濃度也是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效果的最主要因素之一，因此探究其在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的影響十分關(guān)鍵。如果農(nóng)桿菌侵染液含量過(guò)低，就會(huì)有很少的農(nóng)桿菌細(xì)胞和外植體接觸，而無(wú)法進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化;當(dāng)農(nóng)桿菌侵染液含量過(guò)高，農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)部就會(huì)產(chǎn)生相互拮抗使其無(wú)法生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化。皮照興[3]等設(shè)置了5組不同濃度的農(nóng)桿菌侵染液，OD600依次是0.2、0.4、0.6、0.8、1.0。其中，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染液濃度OD600在0.6～0.8，抗性芽再生率最高且差異不大。孫昕[4]等利用不同濃度農(nóng)桿菌菌液(選擇OD600分別為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9)對(duì)“吉育47”大豆進(jìn)行侵染，進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為5d，5d后再進(jìn)行GUS染色，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染液OD600為0.7、0.8、0.9時(shí)，子葉節(jié)區(qū)分生組織的GUS加染色點(diǎn)數(shù)量較多;再進(jìn)一步研究GUS熒光值的數(shù)據(jù)，分析表明，當(dāng)OD600為0.8時(shí)GUS表達(dá)量最大，其次是0.7和0.9，所以選擇農(nóng)桿菌菌液OD600為0.7～0.8范圍內(nèi)侵染“吉育47”大豆其轉(zhuǎn)化效率最好，這也為本文選擇農(nóng)桿菌侵染液濃度提供了參考。叢亞輝[5]等研究發(fā)現(xiàn)，OD650值分別為0.6、0.8和1.0等3個(gè)菌液濃度侵染大豆品種“杰克紫”子葉節(jié)時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率依次是97.0%、90.7%和85.6%，其中，OD650為0.6時(shí)對(duì)大豆子葉節(jié)的侵染能力顯著優(yōu)于0.8和1.0，而“天隆一號(hào)”的試驗(yàn)結(jié)果也與“杰克紫”相同。所以農(nóng)桿菌侵染濃度水平OD650為0.6時(shí)比較適用于大豆子葉節(jié)培養(yǎng)。李姝璇[6]等通過(guò)研究影響農(nóng)桿菌侵染效率的主要因素并以大豆子葉外植體中GUS的瞬時(shí)表達(dá)率來(lái)評(píng)價(jià)農(nóng)桿菌的侵染效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染液濃度OD650為0.6時(shí)，為侵染大豆子葉節(jié)的最適濃度，侵染效率可達(dá)到96%以上。在8個(gè)大豆品種中，“天龍1號(hào)”、“杰克紫”等大豆品種的農(nóng)桿菌感染效率相對(duì)較高。在大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌的侵染濃度影響較大，近年來(lái)在大豆遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中一般選擇OD600為0.6～1.0為最佳侵染濃度。

2 大豆基因型對(duì)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的方法。篩選有利于農(nóng)桿菌感染和組織再生的大豆基因型是建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的重要步驟。由于進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)量高、價(jià)格低，中國(guó)大豆產(chǎn)量在過(guò)去10a中大幅下降。目前，“威廉姆斯82”和“杰克”大豆品種是國(guó)際上常用的大豆轉(zhuǎn)化育種和研究品種。然而，這2個(gè)基因型的農(nóng)藝性狀較差，只適合在狹窄的地區(qū)種植[7]。因此，為了加快我國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆育種的進(jìn)程，研究人員分別選擇不同基因型大豆進(jìn)行探究。2016年，劉晨光[8]等選取了“豫豆22”、“冀豆16”、“中黃42”3個(gè)大豆品種來(lái)探究不同基因型對(duì)子葉節(jié)再生效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同樣的條件下，“豫豆22”芽誘導(dǎo)率和再生率較高，分別是41%和15.3%；“冀豆16”次之，“中黃42”最差。由此可知“豫豆22”適用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化中。同年楊靜小組[9]選擇了2種國(guó)外大豆，9種國(guó)內(nèi)大豆進(jìn)行研究，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中篩選出“杰克”、“華春6號(hào)”、“沈農(nóng)9號(hào)”具有較高的再生率，其中“沈農(nóng)9號(hào)”再生率和轉(zhuǎn)化率均為相對(duì)較高水平，因此適用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化中從而獲得更多植株進(jìn)行研究。2021年，Mi-Suk Seo等[10]報(bào)告了21個(gè)屬于韓國(guó)大豆核心種質(zhì)的大豆品種和2個(gè)國(guó)外品種(“杰克”和“Maverick”)的組織培養(yǎng)效率。在21個(gè)品種中，“關(guān)安”、“安平”和“色南”有著密切的親緣關(guān)系，這3個(gè)品種的發(fā)芽率和再生率都很高。此外，在參考基因組測(cè)序中使用的“威廉82”和2個(gè)外國(guó)品種中也觀察到了較高的組織培養(yǎng)能力。不同品種的大豆對(duì)農(nóng)桿菌的易感程度呈現(xiàn)出顯著的差異，不同基因型的大豆與農(nóng)桿菌間的相互作用不同，因此在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中選擇再生率較高的大豆品種十分必要。

3 篩選劑種類(lèi)及濃度對(duì)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的影響

3.1 篩選劑種類(lèi)

在大豆基因改造領(lǐng)域，篩選標(biāo)記物是篩選利用轉(zhuǎn)基因材料生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，生存、增殖與成熟的重要因子。各種種類(lèi)的篩選劑不但影響了轉(zhuǎn)化效果，同時(shí)也限制了轉(zhuǎn)基因材料的實(shí)用價(jià)值。目前有許多篩選劑，包括了抗生素類(lèi)如潮霉素、卡那霉素，以及除草劑類(lèi)如草甘膦、草胺膦等。

在多種植株的基因轉(zhuǎn)化中，卡那霉素也常被用來(lái)作為抗性檢測(cè)標(biāo)記的主要抗生素之一?？敲顾匾彩前被认偻夥置诩?xì)菌的主要抗生素，其中毒原理為與植株細(xì)胞器葉綠體和線粒體內(nèi)的核糖體30S亞基緊密結(jié)合，進(jìn)而抑制由轉(zhuǎn)錄進(jìn)程所引起的細(xì)胞凋亡;而轉(zhuǎn)化細(xì)菌則具有了對(duì)抗生素的耐受性，從而在某一確定濃度的高選擇性抗生素的選擇培養(yǎng)基中生存了下來(lái);而未轉(zhuǎn)換的細(xì)菌則因?yàn)闆](méi)有該抗性基因，而被抑制或殺滅[11]。

第一批轉(zhuǎn)基因大豆是Hinchee等在1988年使用nptII基因生產(chǎn)的，該基因?qū)⒖敲顾刈鳛橐环N篩選劑。大豆品種對(duì)卡那霉素的反應(yīng)在愈合率方面比較相似，但在褐變率方面不同。王萍[12]等研究發(fā)現(xiàn)，不同大豆外植體對(duì)卡那霉素的反應(yīng)存在顯著差異，以真葉片的反應(yīng)最敏感，下胚軸的反應(yīng)最慢。雖然卡那霉素成本低、適用范圍廣，但不同基因型大豆的耐受性差異較大。

潮霉素抗性基因hpt是目前應(yīng)用較多的標(biāo)記基因之一，已經(jīng)在許多植物的基因功能研究中獲得了應(yīng)用。潮霉素還能阻礙植株細(xì)胞葉綠體、線粒體內(nèi)的核糖體和增長(zhǎng)作用因子EF-2的融合，進(jìn)而抑制多肽鏈的正常生長(zhǎng)。當(dāng)潮霉素在未轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)時(shí)，就可與細(xì)胞中的30S核糖體融合，因而使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成困難，進(jìn)而造成蛋白質(zhì)的逐漸褐化死亡[13]，作用機(jī)理與卡那霉素相似。

草甘膦和草胺膦都是一種有機(jī)磷類(lèi)的除草劑，具有生物活性高、效率高、毒性較小、殺草譜高、易于降解、少殘留，以及對(duì)環(huán)境相對(duì)比較安全等優(yōu)點(diǎn)。其可以殺滅幾乎全部的綠色植物，而且對(duì)動(dòng)物無(wú)害，所以是一種既安全又有效的除草劑，是農(nóng)作物中使用較為普遍的一種除草劑[14]。宋張悅[15]等以草丁膦作為篩選試劑得到了“天隆一號(hào)”等6個(gè)較適宜的大豆受體品種，且平均轉(zhuǎn)化效率都穩(wěn)定在2.4%以上。

3.2 篩選劑濃度

選擇合適的篩選劑濃度也是大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響因素，因?yàn)楹Y選過(guò)程過(guò)嚴(yán)或過(guò)松均會(huì)降低對(duì)轉(zhuǎn)化植株的篩選效率。

劉京等[16]研究了不同質(zhì)量濃度的潮霉素對(duì)發(fā)狀根生長(zhǎng)誘導(dǎo)和根系伸長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，潮霉素可有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，并可用作大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化體系中的篩選試劑。同卡那霉素一樣，不同種類(lèi)的大豆對(duì)潮霉素耐受性有所差異。所得結(jié)果表明，“自貢冬豆”、“吉林小粒1號(hào)”、“吉育47”和“中黃30”在發(fā)狀根誘導(dǎo)階段的潮霉素適宜的篩選濃度依次是40mg·L-1、16mg·L-1、16mg·L-1、24mg·L-1;根伸長(zhǎng)階段則依次為49mg·L-1、46mg·L-1、33mg·L-1、55mg·L-1。宋張悅[15]等又成功構(gòu)建了由一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的以草甘膦作為的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的直接篩選試劑，轉(zhuǎn)化效率0.41%～3.06%。研究人員經(jīng)濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)草甘膦的篩選濃度為100mg·L-1時(shí)，再生率降低了2～3倍，但是轉(zhuǎn)化效率并不受限制?？梢?jiàn)在高濃度篩選過(guò)程中，抗性外植體顯示出了明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，而且高濃度篩選還可以省去不少工作量，對(duì)降低假陽(yáng)性率和增加轉(zhuǎn)基因植株的抗性等方面，都會(huì)有一些效果。

張忻爽等[17]用“合豐35”、“黑農(nóng)44”和“吉林35”的胚尖當(dāng)外植體，研究了不同濃度的卡那霉素和草銨膦對(duì)各種基因型大豆胚尖不定芽所誘導(dǎo)的作用效果。結(jié)果表明，“合豐35”、“黑農(nóng)44”和“吉林35”的適宜卡那霉素的篩選濃度是100mg·L-1，而草胺膦濃度則依次是0.6mg·L-1、0.2mg·L-1和0.2mg·L-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，不同基因型大豆再生體系中對(duì)不同品種及濃度的篩選劑有所不同，因此，在今后針對(duì)某一基因型進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，選用合適的篩選劑及其濃度是十分必要的，同時(shí)還應(yīng)從對(duì)外植體不定芽的誘導(dǎo)率、芽數(shù)和芽長(zhǎng)度等多種因子綜合考察后進(jìn)行判斷。

在大豆遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，如果篩選劑濃度太低，則無(wú)法抑制或殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性植株數(shù)量過(guò)多，進(jìn)而干擾轉(zhuǎn)化植株的篩選和鑒定等工作;若篩選濃度太高，則會(huì)殺死已經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞或抑制其增殖發(fā)育，從而難以獲得已轉(zhuǎn)化植株。所以，人們開(kāi)展了受體材料篩選劑耐受性實(shí)驗(yàn)，以研究設(shè)定合理的篩選臨界濃度，確保理想的篩選效果十分關(guān)鍵[18]。

4 展望

多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的科研人員開(kāi)發(fā)和優(yōu)化了大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)一步證實(shí)并豐富了大豆的基因功能，并獲得了具有更多優(yōu)良性狀的新品種。由于中國(guó)農(nóng)作物主要功能基因組學(xué)的研究開(kāi)發(fā)，以及國(guó)際轉(zhuǎn)基因大豆新品種培育研究工作的開(kāi)展，安全高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展始終是中國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆研發(fā)的重點(diǎn)課題之一。多年的研究已經(jīng)證實(shí)，大豆不定芽再生系統(tǒng)是大豆的遺傳轉(zhuǎn)化的主要途徑。由于大豆對(duì)光周期的敏感，品種推廣應(yīng)用的適應(yīng)范圍有限，今后應(yīng)優(yōu)化大豆的加工方法和再生體系。所以，未來(lái)大豆基因改造技術(shù)將選擇產(chǎn)業(yè)上主栽品種為重點(diǎn)基因型，對(duì)其改造技術(shù)與再生系統(tǒng)加以完善;政府為滿(mǎn)足對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆育種與功能基因研發(fā)的需求，也支持對(duì)其細(xì)胞再生系統(tǒng)的完善與改良。