附芍祛黃顆粒的含量測定及其雙酯型生物堿的限量研究

秦超燕，藍艷梅，李飛燕，王明剛

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

附芍祛黃顆粒是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科毛德文教授治療慢性肝衰竭的經(jīng)驗方，全方由附子、赤芍、人參、大黃等中藥組成。為方便患者攜帶和保存，本院制劑室將原湯劑改為顆粒劑。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對附芍祛黃顆粒中赤芍所含的芍藥苷進行含量檢測，并對附子中存在的雙酯型生物堿進行限量檢測，旨在保障該藥物在臨床使用的安全性和有效性。

1 實驗材料

1.1 儀器Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；SDFY-200A型高速萬能粉碎機（上海喬躍實驗設(shè)備有限公司）；Mettler XSR205十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多集團）；UPC-11-10T優(yōu)普系列超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 試藥 芍藥苷（批號：120917-201712）和烏頭雙酯型生物堿對照提取物（批號：112029-201601）均購自中國食品藥品檢定研究院；附芍祛黃顆粒（批號：20191212、20191214、20191217），由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供；乙腈（美國Fisher公司）和四氫呋喃均為色譜純；甲醇、乙醇和磷酸等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的芍藥苷對照品8.24 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，制成0.329 6 mg/ml的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取附芍祛黃顆粒1.0 g，加入70%乙醇25 ml，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，補足減失的重量，濾過，離心，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相，采取梯度洗脫方式洗脫，洗脫條件見表1；檢測波長230 nm，柱溫30℃，流速1.0 ml/min，進樣量10 μl。在此色譜條件下，芍藥苷與相鄰峰分離良好，結(jié)果見圖1、圖2。

表1 芍藥苷梯度洗脫條件

圖1 芍藥苷對照品色譜圖

圖2 附芍祛黃顆粒樣品色譜圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1 μl、3 μl、5 μl、7 μl、10 μl、15 μl，注入液相色譜儀，按2.1.3項下的色譜條件檢測，以對照品進樣量（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，作線性回歸，得回歸方程為：Y=3.0×106X+869 673（r2=0.999 8）。結(jié)果表明，芍藥苷的線性范圍為0.329 6～4.944 μg，線性關(guān)系良好。見圖3。

圖3 對照品線性關(guān)系圖

2.1.5 精密度試驗 精密吸取上述2.1.1項下的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，按2.1.3項下的色譜條件進行測定，記錄并計算赤芍藥材中芍藥苷的峰面積，結(jié)果RSD為0.47%（n=6），結(jié)果表明該方法精密度較好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h依法測定附芍祛黃顆粒中的芍藥苷的峰面積，結(jié)果顯示附芍祛黃顆粒中的芍藥苷峰面積的RSD值為1.36%（n=6）。其RSD值均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取附芍祛黃顆粒（批號：20191212）樣品6份，按2.1.2項供試品溶液制備方法制備樣品溶液，再按照2.1.3項色譜條件測定樣品成分的峰面積，依據(jù)峰面積計算附芍祛黃顆粒中芍藥苷的平均含量，結(jié)果測得附芍祛黃顆粒中芍藥苷的平均含量為2.992 1 mg/g，RSD值為2.11%（n=6）。其RSD值均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的附芍祛黃顆粒（批號：20191212，芍藥苷含量為2.992 1 mg/g）約0.5 g，共6份，加入芍藥苷對照品，按2.1.2項下方法制備樣品溶液，再按2.1.3項色譜條件進樣測定，計算附芍祛黃顆粒中芍藥苷的平均回收率和RSD值。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

編號 3 4 5 6稱取樣品量（g）0.501 1 0.501 5 0.500 4 0.500 3樣品含量（mg）1.499 3 1.500 5 1.497 2 1.496 9加入量（mg）1.51 1.51 1.51 1.51測得量（mg）2.958 8 3.046 7 2.999 1 2.955 9回收率（%）96.65 102.39 99.46 96.62平均回收率（%）99.53 RSD（%）2.51

2.1.9 樣品含量測定 取本品3批次附芍祛黃顆粒約1.0 g，精密稱定，同上述2.1.2項的方法制備供試品溶液，精密量取10 μl注入高效液相色譜儀，以外標法計算附芍祛黃顆粒中芍藥苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 附芍祛黃顆粒樣品含量測定結(jié)果 （n=3）

2.2 雙酯型生物堿的限量檢測［1-4］

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：乙腈-四氫呋喃（25∶15），流動相B：0.1 mol/L醋酸銨溶液，采取梯度洗脫程序（見表4）；柱溫30℃，檢測波長235 nm，流速1.0 ml/min，進樣量10 μl。

表4 雙酯型生物堿梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的制備 取適量的烏頭雙酯型生物堿對照品提取物（新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿混合對照品），加入異丙醇與二氯甲烷（1∶1）配置成的混合溶液，制備成含新烏頭堿7.925 μg/ml、次烏頭堿7.5 μg/ml、烏 頭 堿7.95 μg/ml的 混 合 對 照 品 溶 液。見圖4。

2.2.3 供試品溶液的制備 取附芍祛黃顆粒約2 g，用氨試液3 ml、異丙醇25 ml與乙酸乙酯25 ml的混合溶液混勻，超聲處理30 min，冷卻后精密稱定重量，用上述混合溶液補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液25 ml，低溫（35℃）減壓回收，干燥至恒重，用異丙醇1 ml與二氯甲烷1 ml的混合溶液溶解殘渣，離心取上清液，即得。

2.2.4 標準曲線的制備 取2.2.2項下的混合對照品溶液，照2.2.1項下色譜條件分別進樣10 μl、12 μl、14 μl、16 μl、18 μl、20 μl測定，以對照品的含量為橫坐標，峰面積為縱坐標做線性回歸方程，結(jié)果見表5、圖5、圖6。

表5 線性關(guān)系考察結(jié)果

圖5 新烏頭堿標準曲線

圖6 次烏頭堿標準曲線

2.2.5 含量測定 取20201212、20201214、20201217批次供試品，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣，測定附芍祛黃顆粒中雙酯型生物堿的含量。結(jié)果附芍祛黃顆粒中檢測不到烏頭堿的存在，新烏頭堿和次烏頭堿總量為0.006 4%。色譜圖見圖7。結(jié)果見表6。

表6 附芍祛黃顆粒中雙酯型生物堿限量檢測結(jié)果 （n=3）

圖7 附芍祛黃顆粒中雙酯型生物堿色譜圖

3 討 論

3.1 HPLC測定條件的選擇 在芍藥苷含量測定的試驗中，曾對流動相（甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液、甲醇-水、乙腈-水）和柱溫（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）進行了考察。研究發(fā)現(xiàn)，最終確定的流動相和柱溫條件對芍藥苷分離度好，峰形穩(wěn)定，保留時間適合，沒有陰性干擾和拖尾現(xiàn)象。此外，還考察了不同流速（0.8 ml/min、1 ml/min、1.2 ml/min），結(jié)果顯示流速1 ml/min效果較好。

3.2 雙酯型生物堿的限量檢測 附子含有毒性較大的雙酯型生物堿，對心臟毒性較大，所以多用其炮制品。本實驗研究的附芍祛黃顆粒所用的就是附子炮制品（黑順片），按照2020版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，經(jīng)過炮制的附子，其雙酯型生物堿（新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿）總量不得過0.010%，本實驗中未檢出烏頭堿，新烏頭堿和次烏頭堿的總量為0.006 4%，結(jié)果符合藥典規(guī)定，保障了臨床用藥的安全。