全懸浮ST細(xì)胞高效培養(yǎng)豬瘟病毒方法的建立與應(yīng)用

夏 偉，宋松林，廉 維，王富猛，何玉友，董雅文

（吉林正業(yè)生物制品股份有限公司，吉林 吉林 132011）

豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）屬黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）有包膜的正鏈RNA病毒。直徑為40～60nm。CSFV以高熱、高死亡率為主要特征，該病從發(fā)現(xiàn)至今一直困擾著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。僅疫苗免疫這個(gè)環(huán)節(jié)就耗費(fèi)了大量的人力和物力。豬瘟C株弱毒疫苗在國(guó)外被廣泛應(yīng)用，歐美地區(qū)豬群應(yīng)用該疫苗已根除該病。但是，該病毒不引起細(xì)胞病變，且病毒難于培養(yǎng)，特別是豬瘟弱毒疫苗C株在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過(guò)程中增殖很難，滴度大約在1×105.5TCID50/mL，迄今為止，豬瘟依然是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一，而且在疫苗生產(chǎn)中也經(jīng)常出現(xiàn)病毒毒價(jià)不穩(wěn)定等問題。為了建立穩(wěn)定生產(chǎn)豬瘟病毒的生產(chǎn)工藝，本試驗(yàn)馴化成功了全懸浮ST細(xì)胞，建立了無(wú)血清高效培養(yǎng)豬瘟病毒方法，為大規(guī)模穩(wěn)定生產(chǎn)CSFV奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒和細(xì)胞 豬瘟病毒C株由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司保存；ST細(xì)胞由上海源培生物科技股份有限公司馴化和保存。

1.1.2 豬瘟陰、陽(yáng)性血清 豬瘟病毒陰、陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 CSFV的IPMA檢測(cè)方法建立 將收獲的CSFV病毒培養(yǎng)物按10倍系列稀釋，接種ST細(xì)胞，培養(yǎng)72h，去掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌3次，利用冰凍甲醇進(jìn)行固定20min，棄掉甲醇溶液，用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌3次，進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定。

（1）浸板：每孔注入200μL的洗滌液，置室溫浸洗一次，輕輕甩出洗液，吸水紙上輕叩。

（2）與血清抗體反應(yīng)：將100倍稀釋的豬瘟陽(yáng)性血清，加入96孔板中，繞后反應(yīng)板置入濕盒內(nèi)，于37℃溫箱中孵育1h。

（3）洗板：每孔注入200μL洗滌液，立即排除洗液，吸水紙上輕叩，重復(fù)3次。

（4）與酶標(biāo)抗體反應(yīng)：每孔注入100μL稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，將反應(yīng)板置入濕盒內(nèi)，于37℃溫箱中孵育1h。

（5）洗板：：每孔注入200μL洗滌液，立即排除洗液，吸水紙上輕叩，重復(fù)3次。

（6）底物顯色：每孔注入100μL底物顯色液（現(xiàn)用現(xiàn)配），于室溫反應(yīng)30min。

（7）終止反應(yīng)：甩出反應(yīng)液，每孔注入100μL蒸餾水沖洗一次，干燥。

（8）在顯微鏡下觀察各孔顯色情況，進(jìn)行樣品結(jié)果判定。

（9）CSFV陽(yáng)性血清與病毒感染細(xì)胞染色后呈棕紅色。

（10）CSFV陰性血清與抗原感染細(xì)胞無(wú)著色反應(yīng)判定為陰性。

大多數(shù)人都在度假時(shí)想要去別處，包括那些自小生活在旅游勝地的人。英國(guó)人最喜歡的度假地是西班牙，因此5月和8月的公眾假期，英國(guó)人會(huì)一下擠滿西班牙的城市和海灘。在街上走半天，聽見的凈是英語(yǔ)。英國(guó)人會(huì)把家庭聚會(huì)或者告別單身的狂歡派對(duì)都搬去西班牙，狂呼痛飲，跟在英國(guó)凄風(fēng)冷雨中那些死樣活氣一錐子扎不出一聲來(lái)的英國(guó)人非常不同。人在異國(guó)，不必顧及面子。我的西班牙同事打算與眾不同一下，在公眾假期選擇去都柏林?；貋?lái)以后我問她都柏林怎么樣，她說(shuō)：“玩得很愉快，對(duì)城市印象很好，都柏林的吉尼斯啤酒比別處的都好喝。美中不足的是大街小巷都是西班牙人?！?/p>

1.2.2 ST細(xì)胞的全懸浮培養(yǎng)

1.2.2.1 細(xì)胞初始接種密度的優(yōu)化 將ST細(xì)胞濃度以20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，分別在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24h取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，活力檢測(cè)。

1.2.2.2 補(bǔ)液方式的優(yōu)化 分別采用半換液和逐步加液的方式在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24h取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，活力檢測(cè)，觀察ST細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇最佳的補(bǔ)液方式。

1.2.2.3 攪拌轉(zhuǎn)速選擇 分別選擇60、80、90、100、120r/min的轉(zhuǎn)速在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24h取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、活力檢測(cè)，觀察ST細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇最適攪拌轉(zhuǎn)速。

1.2.3 豬瘟病毒C株懸浮培養(yǎng)參數(shù)確定

1.2.3.1 接毒劑量的優(yōu)化 按照1%、2%、5%、7.5%和10%的接毒劑量，細(xì)胞濃度為50×104/mL的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞的狀態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)，在接毒后120h收獲，并測(cè)病毒TCID50。確定最佳接毒劑量。

1.2.3.2 細(xì)胞濃度的優(yōu)化 細(xì)胞濃度分別確定為20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，同步接種5%豬瘟病毒，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24h取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，活力檢測(cè)，觀察ST細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，在接毒后120h同時(shí)收獲病毒，測(cè)病毒TCID50。確定最佳細(xì)胞濃度。

2 結(jié)果

2.1 CSFV的IPMA檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果將收獲的CSFV病毒培養(yǎng)物按10倍系列稀釋，接種ST細(xì)胞，培養(yǎng)72h，去掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌3次，利用冰凍甲醇進(jìn)行固定20min，棄掉甲醇溶液，用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌3次，進(jìn)行染色結(jié)果表明，CSFV陽(yáng)性血清孔染出棕紅色細(xì)胞，CSFV陰性血清孔未染出棕紅色細(xì)胞，如圖1所示，因此本試驗(yàn)建立的檢測(cè)CSFV病毒的IPMA方法可以用于CSFV毒價(jià)測(cè)定。

圖1 CSFV染色陽(yáng)性

CSFV染色陰性

2.2 細(xì)胞初始接種密度的優(yōu)化將ST細(xì)胞接種密度以20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，分別在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)（見表1），結(jié)果表明，隨著ST細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到1.0×107/mL以上時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯著變慢，且處于一個(gè)平臺(tái)期不再生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到1.0×107/mL以上時(shí)即使提高接種濃度細(xì)胞也處于停滯生長(zhǎng)狀態(tài)。

表1 不同ST細(xì)胞濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.3 補(bǔ)液方式的確定將ST細(xì)胞接種密度調(diào)整為40×104/mL開始在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在細(xì)胞培養(yǎng)到48h和72h時(shí)進(jìn)行半換液和逐步加液的方式進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在生物反應(yīng)器中，分別在于48h和72h時(shí)更換50%培養(yǎng)基和逐步加液的方式，均可獲得較高的細(xì)胞密度，也避免了營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)低和細(xì)胞代謝產(chǎn)物濃度過(guò)高對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，逐步加液的方式更有利于在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。

2.4 攪拌轉(zhuǎn)速確定將ST細(xì)胞接種密度調(diào)整為40×104/mL開始在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別 定 為60、80、100、120、150r/min，結(jié) 果 表 明，120r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響小，培養(yǎng)3d細(xì)胞生長(zhǎng)密度可達(dá)到620×104/mL，因此，120r/min為最適攪拌轉(zhuǎn)速（見表2）。

表2 不同轉(zhuǎn)速對(duì)ST細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.5 細(xì)胞濃度的確定細(xì)胞濃度分別確定為20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，同步接種5%豬瘟病毒C株，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，在接毒后120h收獲病毒，結(jié)果表明，細(xì)胞濃度在40×104/mL和60×104/mL時(shí)，豬瘟病毒C株病毒滴度可分別達(dá)到107.5TCID50/mL和107.2TCID50/mL即最佳細(xì)胞培養(yǎng)濃度為40～60×104/mL時(shí)，豬瘟病毒毒價(jià)最高（見表3）。

表3 不同ST細(xì)胞濃度對(duì)豬瘟病毒C株增殖的影響

2.6 接毒劑量的確定按照1%、2%、5%、7.5%和10%的接毒劑量，細(xì)胞濃度為40×104/mL的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，5%、7.5%和10%的接毒劑量均能達(dá)到107.1～107.2TCID50/mL（見表4）。

表4 不同濃度豬瘟病毒C株接種劑量對(duì)豬瘟病毒增殖的影響

2.7 收毒時(shí)間的確定ST細(xì)胞濃度確定為40×104/mL，同步5%劑量接毒，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，在接毒后24h、48h、72h、96h和120h分別收獲病毒，結(jié)果表明，120h收獲的病毒滴度可達(dá)到107.1TCID50/mL。確定最佳收毒時(shí)間為120h（見表5）。

表5 不同收毒時(shí)間對(duì)豬瘟病毒增殖的影響

3 討論

目前豬瘟病毒的生產(chǎn)主要采用原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞培養(yǎng)，但是病毒在細(xì)胞上的繁殖能力不強(qiáng)，直接影響病毒的最終滴度。豬瘟病毒在ST細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程中，病毒滴度低是制約豬瘟病毒弱毒疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定的主要原因，豬瘟病毒受到諸多因素的制約，難于繁殖，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，牛血清中常常含有BVDV抗體，對(duì)豬瘟病毒具有較強(qiáng)的中和作用，不利于豬瘟病毒在ST細(xì)胞上復(fù)制，現(xiàn)在豬瘟病毒疫苗半成品生產(chǎn)也有應(yīng)用微載體培養(yǎng)的報(bào)道，但是該方法應(yīng)用的微載體小球價(jià)格昂貴，工藝不好控制，批間差異大，重復(fù)效果不好，細(xì)胞需求量大。并且還有牛血清成分，對(duì)豬瘟病毒培養(yǎng)都是不利的。為了解決這個(gè)問題，本研究采用全懸浮ST細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基高效培養(yǎng)豬瘟病毒，取代了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶和微載體培養(yǎng)工藝，避免了牛血清對(duì)豬瘟病毒繁殖的影響，提高了豬瘟病毒的滴度，解決了豬瘟病毒難于生產(chǎn)的瓶頸問題，同時(shí)該工藝也能節(jié)約人力資源，減小豬瘟疫苗生產(chǎn)利用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)批間差異大的劣勢(shì)，為相關(guān)豬瘟病毒多聯(lián)疫苗的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)該工藝生產(chǎn)的豬瘟病毒弱毒疫苗，減少疫苗的用量，降低了豬群的應(yīng)激，大大提高了豬群的生產(chǎn)性能。